黃鶴鳴，劉彥君，付 榮，石催催，范建高，張?jiān)?，羅 成，李光明

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)發(fā)病率較低，常伴隨有大量的肝細(xì)胞壞死，是一種嚴(yán)重的臨床綜合征。ALF常發(fā)生在沒(méi)有基礎(chǔ)肝臟疾病的人群，預(yù)后極差[1-3]。有研究表明，在ALF的發(fā)病機(jī)制中，巨噬細(xì)胞來(lái)源的促炎癥細(xì)胞因子大量釋放會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死。因此，抑制過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)肝損傷具有一定的保護(hù)作用[4，5]。(+)-JQ1是一種溴結(jié)構(gòu)域和額外末端結(jié)構(gòu)域(bromo-and extra-terminal domain，BET)抑制劑，近期發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗炎作用?；贏LF發(fā)病過(guò)程中存在過(guò)度炎癥反應(yīng)激活導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，推測(cè)(+)-JQ1可能對(duì)ALF具有一定的保護(hù)作用。本研究旨在探討(+)-JQ1對(duì)脂多糖/D氨基半乳糖(LPS/D-Gal)誘導(dǎo)的ALF小鼠的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與主要試劑 雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體質(zhì)量約為24～26 g，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。LPS和D-Gal購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司?？筆-IKB、抗IKB、抗P65、抗P-P65和抗GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology, Inc(CST)公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，(+)-JQ1由中國(guó)科學(xué)院上海藥物所提供。

1.2 ALF小鼠模型的制備 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。將小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(21±2℃，12 h明暗交替光照)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將47只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組15只、ALF模型組17只和(+)-JQ1干預(yù)組15只。在ALF模型組和(+)-JQ1干預(yù)組，給予動(dòng)物L(fēng)PS 2 mg.kg-1和D-Gal 250 mg.kg-1混合溶液(LPS:D-GAL=1:125)0.3 ml腹腔注射。在LPS/D-Gal處理前2 h，在(+)-JQ1干預(yù)組給予動(dòng)物(+)-JQ1 50 mg.kg-10.3 ml腹腔注射，在ALF模型組和對(duì)照組給予同等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射。在LPS/D-Gal刺激4 h后，每組各處死5只小鼠，取血取肝。獲得的全血經(jīng)3000 r/m 4℃離心15 min，取上清，置于-80℃保存。將一部分肝組織浸泡在4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片，HE染色；另一部分保存在-80℃冰箱。將其余小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至72 h，觀(guān)察存活率。

1.3 血清檢測(cè) 使用Chemray240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用ELISA法檢測(cè)TNF-α(美國(guó)Thermo公司)。

1.4 肝組織促炎細(xì)胞因子mRNA檢測(cè) 取適當(dāng)肝組織，研磨后用RNA抽提試劑盒抽提RNA，用Hiscript q-RT SuperMix for q-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，用ChamQ SYBR Qpcr Master Mix 試劑盒(RT-qPCR法)檢測(cè)肝組織TNF-α、IL-6和IL-1B mRNA水平。以GAPDH作為內(nèi)參照，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IL-6正義鏈：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA，反義鏈：TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；TNF-α 正義鏈：5’-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3’，反義鏈：5’-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3’；IL-1B正義鏈：5’-TCTTTGAAGTTGACGGACCC-3’，反義鏈：5’-TGAGTGATACTGCCTGCCTG-3’；GAPDH正義鏈：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA-3’，反義鏈：5’-CCAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG-3’。

1.5 肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法，取適量肝組織，置于裝有200 l RIPA溶液的EP管中，使用組織研磨儀研磨，將獲得的均質(zhì)溶液以最高速離心，取上清，采用BCA法定量檢測(cè)蛋白濃度，用RIPA溶液調(diào)整蛋白濃度。在110 v電泳90 min。，在300 mA條件下50 min分離凝膠，轉(zhuǎn)至NC膜上。用5%牛奶封閉1 h，以GAPDH(CST，97166)為內(nèi)參，分別加抗 P65(CST,8242)、抗P-P65(CST,3033)、抗IKB(CST,4814)和抗P-IKB(CST,2859)抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，加二抗孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，觀(guān)察蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠存活率比較 模型組72 h存活率為16.7%，(+)-JQ1干預(yù)組為60.0%，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；對(duì)照組小鼠全部存活。

2.2 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 在LPS/D-Gal刺激4 h后，小鼠肝臟充血明顯，呈暗紅色，肝臟明顯增大；在(+)-JQ1干預(yù)后小鼠肝臟充血明顯得到改善，肝臟顏色呈淡粉色，且肝臟大小相對(duì)于對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化(圖1)。ALF模型組動(dòng)物肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，充血明顯，大量肝細(xì)胞壞死，伴有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；在(+)-JQ1干預(yù)后，肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，肝臟內(nèi)未見(jiàn)充血，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖2)。

圖1 各組小鼠肝臟大體觀(guān)

圖2 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE,100×)

2.3 各組小鼠血清ALT和AST水平比較 ALF模型組血清ALT和AST顯著高于對(duì)照組，而(+)-JQ1干預(yù)組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較

2.4 各組小鼠血清TNF-α和肝組織細(xì)胞因子mRNA水平比較 對(duì)照組、ALF組和(+)-JQ1干預(yù)組小鼠血清TNF-α水平分別為(2.5±0.5)pg/ml、(631.6±57.5)pg/ml和(139.8±8.1)pg/ml，差異顯著(P<0.05)。ALF組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1B mRNA水平較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，而經(jīng)(+)-JQ1干預(yù)后則顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠肝組織細(xì)胞因子mRNA水平比較

2.5 各組小鼠肝組織NF-KB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組比，模型組肝組織P-IKB和P-P65蛋白表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而(+)-JQ1干預(yù)后P-IKB和P-P65蛋白表達(dá)量顯著減弱(P<0.05)，ALF模型組IKB蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著減弱(P<0.05)，而(+)-JQ1干預(yù)組減弱不顯著(圖3)。

圖3 各組小鼠肝組織NF-KB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量ALF模型小鼠肝組織 P-P65和P-IKB蛋白表達(dá)增強(qiáng)

3 討論

ALF是一種少見(jiàn)但病死率很高的臨床疾病，可由多種因素導(dǎo)致。由于肝衰竭導(dǎo)致腦、腎、肺和心等功能衰竭，病情兇險(xiǎn)。不論哪種病因均伴有肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，體內(nèi)炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱均會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不良的影響[6-8]。ALF時(shí)過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，加重肝臟損傷。當(dāng)肝臟內(nèi)細(xì)胞壞死和細(xì)胞再生無(wú)法達(dá)到平衡時(shí)則會(huì)發(fā)生ALF[9]。因此，精密調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)對(duì)疾病的控制至關(guān)重要[10-13]。有研究表明，BET蛋白在巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，而其抑制劑(+)-JQ1可以有效地抑制過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)[14-16]。經(jīng)腹腔聯(lián)合注射LPS/D-Gal誘導(dǎo)小鼠ALF是經(jīng)典的ALF模型。LPS是革蘭氏陰性菌的主要成分，它主要通過(guò)作用于肝臟枯否細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)肝損傷。LPS可刺激枯否細(xì)胞大量釋放多種促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1B，誘導(dǎo)ALF小鼠肝細(xì)胞壞死和凋亡。血清ALT和AST是肝臟損傷的重要標(biāo)志。ALF患者血清ALT和AST會(huì)明顯升高。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀(guān)察到ALF小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，而且促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1B水平也明顯升高，肝臟組織學(xué)表現(xiàn)為肝臟組織明顯受損，證實(shí)ALF小鼠模型制備成功。此外，(+)-JQ1可以有效地抑制LPS/D-Gal聯(lián)合誘導(dǎo)導(dǎo)致的過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1B分泌，降低血清ALT和AST水平，具有很好的肝臟保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)受多條信號(hào)通路的調(diào)控，NF-KB信號(hào)通路則是其中之一。LPS是NF-KB強(qiáng)有力的激活劑，NF-KB信號(hào)通路激活可導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)增加，NF-KB是多種炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[17, 18]。當(dāng)沒(méi)有外界刺激時(shí)，NF-KB主要位于胞漿，以P65和P50組成的二聚體與IKB結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，IKB蛋白發(fā)生磷酸化而降解，從而暴露出NF-KB，此時(shí)NF-KB二聚體由胞漿轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核，參與多種基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，其中主要包括調(diào)控促炎細(xì)胞因子表達(dá)的基因。在ALF小鼠模型，NF-KB的激活會(huì)促使細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活并且促進(jìn)大量促炎細(xì)胞因子的釋放，在肝細(xì)胞凋亡及肝損傷中發(fā)揮重要作用，與ALF的預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALF模型組IKB蛋白表達(dá)明顯減少，而P-P65和P-IKB蛋白表達(dá)顯著增多。在(+)-JQ1干預(yù)后可明顯下調(diào)P-P65和P-IKB蛋白的表達(dá)，在一定程度上恢復(fù)IKB蛋白的表達(dá)量。因此，考慮(+)-JQ1可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-KB信號(hào)通路來(lái)抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的壞死，從而減輕肝組織結(jié)構(gòu)和肝功能的損傷。目前，ALF尚無(wú)有效的治療方法，(+)-JQ1在防治ALF中可能具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步探討。