李汶嘉 楊偉 羅丹

血脂是生命細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的必需物質(zhì)，廣泛分布在人類機(jī)體中，主要包括血漿中的中性脂肪和類脂，其中前者包括甘油三酯(TG)，后者包括類固醇、固醇、糖脂及磷脂等[1]。血脂異常是冠心病和腦梗死等疾病的危險因素。氟伐他汀屬臨床常見藥物，是目前已知的第一個全化學(xué)合成的降膽固醇藥物，主要作用于肝臟，其藥代動力學(xué)為非線性，即可刺激低密度脂蛋白(LDL)受體的合成和提高其微粒攝取等[2-3]。載脂蛋白E(ApoE)是常見血漿脂蛋白的重要成員之一，是維持人類正常脂質(zhì)代謝的重要物質(zhì)，存在多種脂蛋白中，人體中ApoE通過結(jié)合LDL受體(LDLR)以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。既往臨床研究證實，他汀類藥物利用競爭性結(jié)合羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的活性調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂水平，而ApoE基因多態(tài)性可影響他汀類藥物的調(diào)脂效果[4]。這可能是不同亞型的ApoE基因結(jié)合LDLR能力存在差異導(dǎo)致，但這種差異是否同時造成HMG-CoA還原酶活性的改變尚未完全明確。本研究主要探討ApoE基因526 C>T多態(tài)性與氟伐他汀調(diào)脂作用的相關(guān)性。

對象與方法

1.對象：納入2015年1月～2018年1月我院收治的血脂異?；颊?52例，根據(jù)氟伐他汀治療效果將其分為療效良好組(A組，87例)、療效正常組(B組，42例)、療效不良組(C組，23例)；根據(jù)基因檢測結(jié)果將其分為E2組(E2/E2和E2/E3基因型)37例、E3組(E3/E3和E3/E4基因型)110例、E4組(E2/E4和E4/E4基因型)5例。氟伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品購于海正輝瑞制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H20070168，規(guī)格：40 mg，含量>97.0%)，二肉豆蔻磷脂酰膽堿(DMPC)購于上海健超化學(xué)科技有限公司。二辛可寧酸法(BCA)蛋白檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)相關(guān)試劑和總RNA提取試劑均購于北京全式金公司。PCR擴(kuò)增儀購于杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，全波長酶標(biāo)儀、凝膠成像儀等均購于美國Bio-RAD公司。人體正常肝細(xì)胞(NFHH)和人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)均由美國典型菌種保藏中心(ATCC)提供，其中NFHH為L-02，5～15代，HSF為10～20代。

2.方法

(1)DNA提取和ApoE基因檢測：所有患者均抽取靜脈血5 ml，采用人血DNA提取試劑盒提取DNA后，利用PCR-熒光探針法檢測3組患者的ApoE基因。

(2)氟伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品貯備液制備：精確稱取氟伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg與二甲基亞礬(DMSO)5 ml配制成貯備液(5 mg/ml)后置于-20 ℃冰箱中保存，于臨用前稀釋。

(3)ApoE-DMPC復(fù)合物制備：取10 mg DMPC標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 ml的氯仿/甲醇(3∶1)中，待其揮發(fā)干燥后加入0.05 mol/L氯化鈉溶液0.15 g/ml、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(pH=7.6)緩沖液1 ml及HCl配置成1 mmol/L溶液，隨后將其置于30 ℃的超聲下處理0.5 h。待上述步驟完成后，將100 mg的ApoE溶于1 ml上述緩沖液中，然后將其加入超聲處理后的DMPC溶液50 μl中混勻，在常溫下過夜待用。最后將其保存于4 ℃冰箱中待用，臨用前稀釋處理。

(4)氟伐他汀與L-02細(xì)胞株的毒性試驗：采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法檢測不同濃度氟伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品對L-02細(xì)胞活性的影響。

(5)PCR反應(yīng)體系：cDNA 4 μl、Supermix 12.5 μl及引物各1 μl加入ddH2O中配制至25 μl；隨后將HMG-CoA還原酶cDNA與Supermix各3 μl、12.5 μl及引物各1 μl再次加入ddH2O中配制至25 μl待用。引物序列見表1。

表1 引物序列

(6)PCR反應(yīng)條件：LDLR、HMG-CoA還原酶的預(yù)變性、變性、退火、延伸條件見表2，上述4個步驟均30個循環(huán)后再延伸(溫度：72 ℃，時間：10min)，隨后將其置于4 ℃冰箱中保存待用。

表2 PCR反應(yīng)條件

(7)ApoE基因多態(tài)性與LDLR結(jié)合的相關(guān)性：將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞接種于24孔板，每孔接種約5×104個細(xì)胞，待其長滿后在無血清培養(yǎng)基上誘導(dǎo)LDLR活性，24 h后棄去上述培養(yǎng)基，然后在無血清培養(yǎng)基上加入20 μg/ml的LDL和ApoE-DMPC復(fù)合物1 ml并確保每孔中的LDL終濃度均為10 μg/ml，而ApoE終濃度分別為0 μg/ml、0.12 μg/ml、0.25 μg/ml、0.50 μg/ml、1.00 μg/ml、2.00 μg/ml。每孔設(shè)3個復(fù)孔，將上述配制好的LDL、ApoE終濃度溶液置于4 ℃下結(jié)合120 min。然后每孔取上清液500 μl以1 000 r/min離心10 min后取上清液并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測未結(jié)合的LDL，采用BCA法檢測裂解細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。各等位基因與SNPs、基因型與檢測位點的對應(yīng)關(guān)系見表3。

表3 各等位基因與SNPs、基因型與檢測位點的對應(yīng)關(guān)系

(8)LDLR mRNA、HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)水平的檢測：將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞接種于24孔板，每孔接種約5×104個細(xì)胞。直至細(xì)胞貼壁，然后用無血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)120 min。根據(jù)不同組別配制待檢溶液(表4)，配制要求均按MTT實驗操作執(zhí)行，其中各藥實驗濃度均按半抑制濃度(IC50)配制，每組設(shè)3個復(fù)孔。加藥成功24 h后提取5組細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR檢測HMG-CoA還原酶和LDLR mRNA的表達(dá)水平。

表4 不同組別的培養(yǎng)基配制情況

結(jié) 果

1.ApoE不同基因型對競爭性結(jié)合LDLR能力的影響：E2組、E3組、E4組的LDLR最大置換量分別為(3.89±0.37)μg/mg、(6.87±0.22)μg/mg、(6.12±0.34)μg/mg，其中E3組明顯高于E2組和E4組，E4組明顯高于E2組(P<0.05)。

2.152例血脂異?；颊逜poE等位基因和基因型頻率檢測結(jié)果：152例血脂異?；颊咧?，ApoE等位基因E3出現(xiàn)的頻率高于E2和E4(P<0.05)，而ApoE等位基因E2和E4出現(xiàn)的頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 152例血脂異?；颊逜poE等位基因和基因型頻率檢測結(jié)果

3.患者不同ApoE基因型分布情況及E2組、E3組、E4組療效優(yōu)良率比較：A組、B組、C組患者不同ApoE基因型分布情況見表6。療效優(yōu)良包括療效良好和療效正常。E2組、E3組、E4組療效優(yōu)良率分別為19.74%(30/152)、55.92%(85/152)、9.21%(14/152)，其中E2組高于E3組、E4組(P<0.001)。

表6 A組、B組、C組患者不同ApoE基因型分布情況[例，(%)]

討 論

從目前的研究結(jié)果而言，ApoE基因在人體中有顯著的遺傳多態(tài)性，相對常見的異構(gòu)體包括ApoE2、ApoE3、ApoE4，其中突變型為ApoE2、ApoE4，而野生型為ApoE3。有學(xué)者采用多重單堿基延伸(SNaPshotSNP)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、膽固醇24 s-羥化酶(CYP46)及ApoE等基因均有顯著的多態(tài)性，且種族差異不明顯。ApoE是一種常見的堿性蛋白，富含精氨酸，由299個氨基酸殘基構(gòu)成[6]，由肝臟中的肝實質(zhì)細(xì)胞(PMC)和腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞合成。據(jù)統(tǒng)計，ApoE作為LDLR的配體之一，其與血漿中TG和膽固醇的運(yùn)輸及代謝明顯相關(guān)，故臨床上將其作為脂類代謝及心血管疾病的主要決定分子。既往研究結(jié)果顯示，ApoE不僅參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)組織再生，還參與水解脂肪酶類的激活和血小板聚集的抑制等[7]。

本研究結(jié)果顯示，E3組LDLR最大置換量高于E2組和E4組，且E4組高于E2組，提示E2、E4突變基因在LDLR中的競爭性結(jié)合力較E3低，且E2低于E4。在人體的各種細(xì)胞和組織中，如血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等中均有一定量的LDL分布。本研究選用HSF細(xì)胞的原因為LDLR直接與機(jī)體中的LDL相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ApoE不同基因型均可在HSF上的LDLR結(jié)合，但ApoE的結(jié)合力較LDL更強(qiáng)。與之對應(yīng)的是，ApoE受體活性越大時，LDL被置換出來的比例也越高，提示ApoE受體活性與LDL被置換率呈正比。另外，本研究中ELISA檢測結(jié)果顯示，本次納入的細(xì)胞培養(yǎng)基中同樣有ApoE未與細(xì)胞的LDLR結(jié)合。有學(xué)者通過間接法比較ApoE2、ApoE3、ApoE4的競爭性結(jié)合實驗后證實，隨著LDL濃度遞增，不同基因型的ApoE與LDLR結(jié)合的能力越低，即越接近飽和，這與本研究結(jié)果相對接近[8]，表明突變型E2、E4的受體結(jié)合活性較野生型ApoE(E3)低，突變型E2最低。上述研究結(jié)果間接證實，采用LDLR檢測血脂異常人群的ApoE2具有敏感性高、特異性強(qiáng)和操作簡便等優(yōu)勢。相關(guān)研究也證實上述方法在檢測大樣本時同樣具有上述特點[9]。本研究152例血脂異常患者中，ApoE2、ApoE3、ApoE4等位基因的頻率分別為15.46%、63.82%和20.72%，E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4基因型的頻率分別為1.32%、14.47%、2.63%、60.53%、11.84%和0.66%，表明ApoE2基因多態(tài)性與氟伐他汀的相關(guān)性較ApoE3低，ApoE3基因多態(tài)性與氟伐他汀的相關(guān)性較ApoE4高，而ApoE2基因多態(tài)性與氟伐他汀的相關(guān)性與ApoE4比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能為人體中的精氨酸與半胱氨酸突變或多或少地降低ApoE2基因多態(tài)性，這與相關(guān)文獻(xiàn)[10]報道的ApoE2基因有缺陷基本相符。

本研究結(jié)果顯示，E2組的療效優(yōu)良率高于E3組、E4組，表明在對血脂異常人群的臨床治療過程中，合理地給予氟伐他汀治療有較好的降脂療效。當(dāng)然也提示ApoE2基因多態(tài)性與疾病嚴(yán)重程度可能存在聯(lián)系，即疾病治療時的降脂效果越好，ApoE2基因的多態(tài)性越低。簡言之，氟伐他汀的降脂作用強(qiáng)弱與ApoE2基因多態(tài)性呈反比，但二者之間的具體作用機(jī)制尚未明確。氟伐他汀的作用部位在肝臟，既往臨床研究結(jié)果證實，氟伐他汀不僅對內(nèi)源性膽固醇的合成有抑制作用，還可使肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量降低，刺激LDLR合成并使LDL微粒攝取提高[11]。還應(yīng)注意的是，氟伐他汀同樣可降低血漿總膽固醇水平。

從本研究結(jié)果而言，ApoE2基因多態(tài)性與氟伐他汀調(diào)脂作用的相關(guān)性可能與以下原因有關(guān)：(1)ApoE2基因多態(tài)性作為常見的位點C等位基因在一定程度上可減弱OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[12]，氟伐他汀較辛伐他汀的脂溶性更低，繼而不容易分布于人體的肌肉組織或引起相關(guān)疾病。(2)ApoE2基因多態(tài)性決定了人體肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體對氟伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)效率有一定的調(diào)控機(jī)能[13]，其在機(jī)體正常或異常不顯著的狀態(tài)下產(chǎn)生的不良反應(yīng)更低。(3)氟伐他汀可有效抑制HMG-CoA還原酶的表達(dá)效能，這與ApoE基因突變位點可減少LDL置換量，從而促使HMG-CoA還原酶呈高表達(dá)有關(guān)[14]；但近年來的研究結(jié)果又證實，HMG-CoA還原酶受ApoE2的抑制作用極低，而當(dāng)ApoE4存在時，機(jī)體中丹參素的抑制效能較無ApoE4時更明顯，這可能與丹參素和突變型E4、氟伐他汀和突變型E2在機(jī)體中形成某種尚未發(fā)現(xiàn)的復(fù)合物而使氟伐他汀在血脂異常人群中的整體治療效果被抑制有關(guān)[15]，也提示ApoE2基因多態(tài)性與氟伐他汀的調(diào)脂作用具有相關(guān)性。

綜上所述，對于血脂異常而應(yīng)用氟伐他汀治療者，ApoE基因526 C>T多態(tài)性對氟伐他汀有較好的降脂效能，可在檢測ApoE基因526 C>T多態(tài)性和獲取相關(guān)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上制定相關(guān)的氟伐他汀治療方案以降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。