柴青川 王西兵 張永杰 劉世國 劉穎 梁惠

[摘要] 目的 探討編碼鈉離子依賴性維生素C轉運蛋白1（SVCT1）的溶質載體家族23成員1（SLC23A1）基因rs10063949位點多態(tài)性與子癇前期遺傳易感性的關系及子癇前期病人血清維生素C水平的變化。方法 選取山東地區(qū)1 029例子癇前期病人（病例組）和1 037例正常孕婦（對照組）作為研究對象，提取外周血DNA，采用TaqMan探針實時熒光PCR技術檢測rs10063949位點基因型分布和等位基因頻率;另外從病例組和對照組中隨機抽取40例子癇前期病人和21例正常孕婦，測定其血清維生素C水平。結果 病例組和對照組相比，SLC23A1基因rs10063949位點的基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性（P>0.05），血清維生素C水平差異也無顯著性（P>0.05）。結論 在山東漢族孕婦人群中SLC23A1基因rs10063949位點多態(tài)性可能與子癇前期遺傳易感性沒有關聯(lián);子癇前期病人血清維生素C水平未見明顯變化。

[關鍵詞] 先兆子癇;鈉偶聯(lián)維生素C轉運子;多態(tài)性，單核苷酸;氧化性應激;抗壞血酸

[中圖分類號] R714.244;R394.5 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）06-0657-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.158 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200720.1444.007.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the association of rs10063949 polymorphism of the solute carrier family 23 member 1 （SLC23A1） gene encoding sodium-dependent vitamin C transporter 1 （SVCT1） with the genetic susceptibility of preeclampsia， as well as the change in the serum level of vitamin C in patients with preeclampsia. ?Methods A total of 1 029 patients with preeclampsia and 1 037 normal pregnant women in Shandong， China were enrolled as case group and control group， respectively. Peripheral blood DNA was extracted， and TaqMan probe real-time fluorescence PCR was used to detect the genotype distribution and allele frequency at rs10063949. In addition， 40 patients with preeclampsia and 21 normal pregnant women were randomly selected from the case group and the control group to measure the serum level of vitamin C. ?Results There were no significant diffe-rences in genotype distribution and allele frequency at the rs10063949 locus of the SLC23A1 gene between the case group and the control group （P>0.05）. There was also no significant difference in the serum level of vitamin C between the two groups （P>0.05）. ?Conclusion The SLC23A1 rs10063949 polymorphism may not be associated with the genetic susceptibility of preeclampsia in the Chinese Han pregnant women in Shandong and there is no significant change in the serum level of vitamin C in patients with preeclampsia.

[KEY WORDS] pre-eclampsia; sodium-coupled vitamin C transporters; polymorphism， single nucleotide; oxidative stress; ascorbic acid

子癇前期（PE）為一種妊娠期高血壓疾病，主要表現(xiàn)為妊娠20周后病人出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，并伴肝、腎、中樞神經系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等多臟器功能損害[1]。全球PE的發(fā)病率為3.2%～12.0%，我國發(fā)病率為4.2%，PE已成為孕產婦和圍生期死亡的主要原因[2]。PE的病因和發(fā)病機制尚不清楚，目前認為與子宮螺旋小動脈重鑄障礙、炎癥免疫過度激活、血管內皮受損、胰島素抵抗、遺傳等因素有關[3-5]。有證據(jù)表明，氧化應激和胎盤抗氧化能力降低與PE的發(fā)生有關[6-9]。在妊娠早期，胎盤循環(huán)中氧消耗的增加伴隨著活性氧（ROS）的生成增加[10]，ROS大量積聚可引起脂質過氧化、蛋白質羰基化和DNA氧化，導致血管內炎癥反應和內皮細胞功能障礙[9]。谷胱甘肽過氧化物酶、維生素C、維生素E等抗氧化劑可以消除ROS對細胞過氧化的作用，抑制細胞損傷，維持細胞膜的完整性。當ROS的產生與抗氧化防御機制之間的平衡被打破時，就會產生氧化應激，從而進一步導致PE的發(fā)生[11-12]。

維生素C作為血漿中最有效的抗氧化劑之一，能夠有效地清除氧自由基[13]。有研究結果顯示，PE病人血清中維生素C的濃度低于正常孕婦，維生素C攝入量的增加能降低PE發(fā)生的風險[14]。鈉依賴性維生素C轉運蛋白1（SVCT1）由溶質載體家族23成員1（SLC23A1）基因編碼，主要參與小腸對維生素C的吸收和腎臟對維生素C的重吸收[15]。CORPE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SLC23A1基因rs35817838、rs33972313、rs6886922及rs34521685單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點不同的基因型會導致人體血漿維生素C的含量不同，提示SVCT1與人體內的維生素C水平相關。英國的一項隊列研究發(fā)現(xiàn)，SLC23A1基因rs10063949位點與血液中維生素C水平增加有關[17]。目前該位點與PE是否相關尚不清楚。因此，本研究擬探討PE病人體內維生素C水平及SLC23A1基因rs10063949位點多態(tài)性與山東地區(qū)PE風險的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2014年1月—2016年12月，于青島大學附屬醫(yī)院、煙臺毓璜頂醫(yī)院、濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院、臨沂市人民醫(yī)院、聊城市人民醫(yī)院、棗莊市婦幼保健院，選取PE病人1 029例（病例組）和正常孕婦1 037例（對照組）。排除標準：有慢性高血壓、腎臟疾病和（或）胰島素依賴型糖尿病、雙胎或多胎、葡萄胎、前置胎盤、胎兒積水、肝功能障礙、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或系統(tǒng)性疾病等疾病;有吸煙、飲酒史者。對照組孕婦未行人工授精，未發(fā)生胎膜早破、前置胎盤、先兆流產、雙胎、巨大兒、早產等疾病。對照組、病例組平均年齡分別為（30.06±5.82）、（30.26±3.93）歲，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究獲青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

PE的診斷標準：妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥18.62 kPa和（或）舒張壓≥11.97 kPa，伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或隨機尿蛋白（+）[18]。重度PE臨床表現(xiàn)：血壓和尿蛋白持續(xù)升高，發(fā)生母體臟器功能不全或胎兒并發(fā)癥。參照謝幸等主編的《婦產科學》（第8版），將34周之前發(fā)病者歸為早發(fā)型PE，34周之后發(fā)病者歸為晚發(fā)型PE。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集所有研究對象外周肘靜脈血2 mL，EDTA抗凝，凍存于-80 ℃冰箱。用DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。

1.2.2 SLC23A1基因rs10063949位點多態(tài)性檢測應用TaqMan探針實時熒光PCR技術對SLC23A1 rs10063949位點進行多態(tài)性分析。rs10063949位點檢測前引物為5′-GGCCTTGTGCCAAGAAAC-AT-3′，后引物為 5′-TCCATCTAATGCTCCTGCTATCTTT-3′。TaqMan等位基因鑒別的實時PCR體系25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、20×SNP探針1.25 μL、DNA無酶水10.25 μL和目的DNA 1 μL。在C1000TM熱循環(huán)儀和CFX96TM實時系統(tǒng)（BIO-RAD，Hercules，CA）中進行擴增，條件如下：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共45個循環(huán)。在每個周期中，分別采集VIC或FAM標記探針的熒光信號。采用Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件進行基因型判別。

1.2.3 血清維生素C水平檢測 采用隨機抽樣方法，從病例組和對照組中分別抽取40例PE病人和21例正常孕婦，測定其血清維生素C水平。采集外周肘靜脈血4 mL至非抗凝管中，以3 500 r/min離心10 min，取血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測血清維生素C含量，檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，嚴格按照說明書進行操作。本次實驗質控值均在規(guī)定范圍內。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組人口學特征和臨床特征的比較采用t檢驗;兩組等位基因頻率和基因型分布的比較采用卡方檢驗，用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）來表示相對危險度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 ?果

2.1 兩組人口學特征和臨床特征的比較

病例組病人的年齡、妊娠和流產次數(shù)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與對照組相比，病例組孕周早（t=7.32，P<0.01）、子代出生體質量低（t=27.47，P<0.01）、收縮壓和舒張壓均升高（t=66.65、65.42，P<0.01），外周血谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）的水平明顯升高（t=7.43、8.02，P<0.01）。見表1。

2.2 遺傳分析

2.2.1 兩組基因型分布和等位基因頻率比較 對照組孕婦rs10063949位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。兩組孕婦SLC23A1基因rs10063949位點的基因型分布差異無顯著意義（χ2=2.96，P>0.05），等位基因頻率差異也無顯著性（χ2=2.11，P>0.05）。將基因型進一步分為C等位基因顯意義（CC/CT+TT）和T等位基因隱性（TT/CC+CT）亞組再進行比較，兩組間差異仍未有顯著性（χ2=0.68、2.89，P>0.05）。見表2。

2.2.2 早發(fā)型、晚發(fā)型PE與對照組基因型分布和等位基因頻率的比較 早發(fā)型、晚發(fā)型PE病人與對照組比較，rs10063949位點的基因型分布差異無顯著意義（χ2=3.17、1.05，P>0.05），等位基因頻率差異也無顯著意義（早發(fā)型PE與對照組：χ2=2.64，P>0.05，OR=1.15，95%CI=0.97～1.35;晚發(fā)型PE與對照組：χ2=0.57，P>0.05，OR=1.06，95%CI=0.91～1.24）。見表3。

2.2.3 輕度、重度PE與對照組基因型分布和等位基因頻率的比較 輕度和重度PE病人與對照組比較，rs10063949位點的基因型分布差異無顯著意義（χ2=2.00、3.18，P>0.05），等位基因頻率差異也無顯著意義（輕度PE與對照組比較：χ2=1.76，P>0.05，OR=1.17，95%CI=0.93～1.48;重度PE與對照組比較：χ2=1.36，P>0.05，OR=1.09，95%CI=0.95～1.25）。見表4。

2.3 兩組血清維生素C水平比較

兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;PE病人孕周明顯早于正常孕婦（t=4.26，P<0.05）;與正常孕婦比較，PE病人血清維生素C水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

3 討 ?論

PE嚴重威脅孕婦及胎兒的健康，但目前PE的發(fā)病機制還尚未闡明。近年來，研究人員試圖用胎盤缺血、氧化應激、內皮損傷、免疫學理論和遺傳學理論等多種理論來解釋PE的發(fā)病機制[19]。氧化應激是PE發(fā)病的重要原因，正常妊娠時，氧化/抗氧化水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但在PE病人中，由于中性粒細胞浸潤和多種蛋白酶釋放產生了大量的中間產物，使氧化產物增多，抗氧化物質減少，產生過多的氧化應激反應，導致細胞損傷[20]，使滋養(yǎng)細胞侵襲不足和子宮螺旋小動脈重塑障礙，從而導致胎盤灌注減少和PE的發(fā)生[21]。維生素C是一種抗氧化劑，可以與氧自由基反應而清除活性氧，參與多種生理病理的氧化應激反應，包括清除在此過程中產生的氧化物和氮化物，抑制動脈內皮細胞產生脂質過氧化物，從而保護細胞。維生素 C可以提高滋養(yǎng)細胞的抗氧化能力，參與胚胎形成、胎兒正常生長發(fā)育，對維持正常妊娠具有重要作用[22-23]。如果孕婦體內維生素C含量不足，抗氧化能力降低，氧化與抗氧化平衡失調，就會使子宮動脈的侵襲能力降低，滋養(yǎng)細胞從上皮細胞特征轉變?yōu)閮绕ぜ毎卣鳒p少，造成子宮螺旋小動脈重鑄障礙，胎盤血流量降低，從而造成母體與胎兒的氧氣和營養(yǎng)物質轉運障礙，導致胎盤缺血和各種炎癥因子的分泌，進一步引起PE的發(fā)生。維生素C攝入量的增加能降低PE發(fā)生的風險[14]。

人體自身不能合成維生素C，需要從食物中攝取。人體對維生素C的吸收主要依賴于鈉離子維生素 C 轉運蛋白（包括SVCT1和SVCT2），其中SVCT1由SLC23A1基因（位于染色體5q31.2-q31.3）編碼[15，24]，在小腸吸收維生素C及腎重吸收維生素C中發(fā)揮重要的作用。TIMPSON等[17]研究發(fā)現(xiàn)， rs10063949位點SNP與血液中維生素C增加有關。敲除部分SVCT1基因的小鼠體內維生素C含量極低，維生素C在小腸內吸收明顯減少，肝臟幾乎不能儲存維生素C，尿液中維生素C含量明顯增多[16]。敲除SVCT1基因的SLC23A1（-/-）小鼠體內各組織中維生素C含量明顯降低甚至不能檢測到[25]。陳娟娟等[26]研究結果顯示，PE病人外周血及臍血維生素C含量顯著低于正常孕婦，胎膜和胎盤中SVCT1的陽性表達顯著低于對照組。由此推測，SLC23A1基因rs10063949位點可能影響維生素C的吸收，導致PE發(fā)生。

本研究結果顯示，PE病人和對照組SLC23A1基因rs10063949位點的基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性。將基因型分為C等位基因顯性（CC/CT+TT）和T等位基因隱性（TT/CC+CT）亞組進行比較，兩組間差異仍無顯著性。本研究進一步將PE病人分為輕、重度和早、晚發(fā)型，分別與對照組進行比較，結果顯示rs10063949位點基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性?？傊?，本研究未顯示SLC23A1基因rs10063949位點多態(tài)性在山東地區(qū)漢族人群PE發(fā)生發(fā)展中的作用，提示該位點對山東地區(qū)漢族人群PE的發(fā)病可能沒有影響。由此推測，SLC23A1基因rs10063949位點可能不會影響山東地區(qū)漢族人群維生素C的吸收。

雖然有研究顯示PE病人體內血清維生素C水平明顯低于正常孕婦[27-28]，但本研究中PE病人維生素C水平與對照組相比沒有顯著降低。BASARAN等[29]通過分析15項補充抗氧化劑試驗，認為補充維生素C并不能預防PE。ROBERTS等[30]對妊娠9～16周孕婦的研究結果表明，聯(lián)合補充維生素C（1 000 mg/d）和維生素E（400 U/d）不能降低PE發(fā)病率。推測原因可能與胎盤細胞、內皮細胞吸收維生素C，維生素C在細胞內代謝、發(fā)揮抗氧化作用有關，這還需要做進一步的研究。

PE是一種復雜的多致病因素的疾病，遺傳背景、生活方式、飲食、季節(jié)氣候、體質量指數(shù)、吸煙、飲酒、營養(yǎng)等多種因素可能會影響PE的發(fā)生發(fā)展。本研究存在以下不足：樣本選自山東省內，并且只研究了SLC23A1基因rs10063949位點這一個基因位點，PE發(fā)病可能還與其他多個基因位點有關;沒有對樣本周圍環(huán)境、生活方式以及胎兒等方面進行研究分析;血清中維生素C水平反映近期維生素C的攝入情況，未能檢測PE病人組織中維生素C的儲存水平;沒有對SLC23A1基因rs10063949位點與山東地區(qū)漢族人群血清維生素C水平及體內維生素C儲存水平是否相關進行分析。因此，有必要在不同的種族和地區(qū)進行涉及SLC23A1基因的大規(guī)模研究，并進行功能和環(huán)境分析，進一步探討PE的發(fā)病機制。

[參考文獻]

[1] MOL B， ROBERTS C T， THANGARATINAM S， et al. Pre-eclampsia[J]. Lancet， 2016，387（10022）：999-1011.

[2] 莊彩霞，劉俊濤，高勁松. 中國人群子癇前期發(fā)病率和臨床危險因素分析[J]. 生殖醫(yī)學雜志， 2019，28（4）：336-341.

[3] RANA S， KARUMANCHI S A， LINDHEIMER M D. Angiogenic factors in diagnosis， management， and research in preeclampsia[J]. Hypertens Dallas Tex：1979， 2014，63（2）：198-202.

[4] JEBBINK J， WOLTERS A， FERNANDO F， et al. Molecular genetics of preeclampsia and HELLP syndrome-a review[J]. Biochim et Biophys Acta， 2012，1822（12）：1960-1969.

[5] JIA R Z， DING G C， GU C M， et al. CDX2 enhances HTR-8/SVneo trophoblast cell invasion by altering the expression of matrix metalloproteinases[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2014，34（3）：628-636.

[6] HANSSON S R， NV， ERLANDSSON L. Oxidative stress in preeclampsia and the role of free fetal hemoglobin[J]. Front Physiol， 2014，5：516.

[7] FUJITA D， TANABE A， SEKIJIMA T， et al. Role of extracellular signal-regulated kinase and AKT cascades in regulating hypoxia-induced angiogenic factors produced by a trophoblast-derived cell line[J]. J Endocrinol， 2010，206（1）：131-140.

[8] WIKSTRM A K， NASH P， ERIKSSON U J， et al. Evidence of increased oxidative stress and a change in the plasminogen activator inhibitor （PAI）-1 to PAI-2 ratio in early-onset but not late-onset preeclampsia[J]. Am J Obstet Gynecol， 2009， 201（6）：597.e1-597.e8.

[9] WU F， TIAN F J， LIN Y. Oxidative stress in placenta： health and diseases[J]. Biomed Res Int， 2015， 2015：293271.

[10] GAO H J， LIU C， LIN P， et al. Effects of GSTP1 and GPX1 polymorphisms on the risk of preeclampsia in Chinese Han women[J]. Cell Physiol Biochem： Int J Exp Cell Physiol Biochem Pharmacol， 2016，39（5）：2025-2032.

[11] CHAIWORAPONGSA T， CHAEMSAITHONG P， YEO L， et al. Pre-eclampsia part 1： current understanding of its pathophysiology[J]. Nature Reviews Nephrology， 2014，10（8）：466-480.

[12] SNCHEZ-ARANGUREN L C， PRADA C E， RIAO-MEDINA C E， et al. Endothelial dysfunction and preeclampsia： role of oxidative stress[J]. Frontiers in Physiology， 2014，5：372.

[13] MERCER B M， ABDELRAHIM A， MOORE R M， et al. The impact of vitamin C supplementation in pregnancy and in vitro upon fetal membrane strength and remodeling[J]. Reproductive Sci Thousand Oaks Calif， 2010，17（7）：685-695.

[14] KAZEMIAN E， DOROSTY-MOTLAGH A R， SOTOUDEH G， et al. Nutritional status of women with gestational hypertension compared with normal pregnant women[J]. Hypertens Pregnancy， 2013，32（2）：146-156.

[15] BRZLE M， SUZUKI Y， ACKERMANN D， et al. Thesodium-dependent ascorbic acid transporter family SLC23[J]. Mol Aspects Med， 2013，34（2-3）：436-454.

[16] CORPE C P， TU H B， ECK P， et al. Vitamin C transporter Slc23a1 links renal reabsorption， vitamin C tissue accumulation，and perinatal survival in mice[J]. J Clin Investig， 2010，120（4）：1069-1083.

[17] TIMPSON N J， FOROUHI N G， BRION M J， et al. Genetic variation at the SLC23A1 locus is associated with circulating concentrations of L-ascorbic acid （vitamin C）： evidence from 5 independent studies with >15，000 participants[J]. Am J Clin Nutr， 2010，92（2）：375-382.

[18] 中華醫(yī)學會婦產科學分會妊娠期高血壓疾病學組. 妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）[J]. 中華圍產醫(yī)學雜志， 2016，19（3）：161-169.

[19] DE SOUSA ROCHA V， DELLA ROSA F B， RUANO R， et al. Association between magnesium status， oxidative stress and inflammation in preeclampsia： a case-control study[J]. Clinical Nutrition， 2015，34（6）：1166-1171.

[20] GUPTA S， AZIZ N， SEKHON L， et al. Lipid peroxidation and antioxidant status in preeclampsia： a systematic review[J]. Obstet Gynecol Surv， 2009，64（11）：750-759.

[21] JAUNIAUX E， WATSON A L， HEMPSTOCK J， et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. A possible factor in human early pregnancy failure[J]. Am J Pathol， 2000，157（6）：2111-2122.

[22] JAUNIAUX E， CINDROVA-DAVIES T， JOHNS J， et al. Distribution and transfer pathways of antioxidant molecules inside the first trimester human gestational sac[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2004，89（3）：1452-1458.

[23] 鐘少平，劉霞，周曉宇，等. 維生素C對缺氧誘導人滋養(yǎng)細胞凋亡的影響研究[J]. 中國婦幼保健， 2012，27（25）：3980-3982.

[24] BRZLE M， HEDIGER M A. Functional and physiological role of vitamin C transporters[J]. Curr Top Membr， 2012，70：357-375.

[25] SOTIRIOU S， GISPERT S， CHENG J， et al. Ascorbic-acid transporter Slc23a1 is essential for vitamin C transport into the brain and for perinatal survival[J]. Nature Medicine， 2002，8（5）：514-517.

[26] 陳娟娟，程澄，謝玉珍，等. 維生素C及其轉運體SVCT在子癇前期發(fā)病機制中的作用研究[J]. 實用婦產科雜志， 2016，32（4）：282-285.

[27] 甘艷瓊，陳朝霞，張娟，等. 妊娠期維生素C、E及微量元素銅、鋅與子癇前期相關性研究[J]. 中國婦產科臨床雜志， 2019，20（5）：456-457.

[28] LLURBA E， GRATACS E， MARTN-GALLN P， et al. A comprehensive study of oxidative stress and antioxidant status in preeclampsia and normal pregnancy[J]. Free Radic Biol Med， 2004，37（4）：557-570.

[29] BASARAN A， BASARAN M， TOPATAN B. Combined vitamin C and E supplementation for the prevention of preeclampsia： a systematic review and meta-analysis[J]. Obstetrical & Gynecological Survey， 2010，65（10）：653-667.

[30] ROBERTS J M， MYATT L， SPONG C Y， et al. Vitamins C and E to prevent complications of pregnancy-associated hypertension[J]. N Engl J Med， 2010，362（14）：1282-1291.

（本文編輯 馬偉平）