張妮 趙龍 劉曉莉 孔雨佳

[摘要] 目的 探討肺腺癌病人血液中miR-1293、miR-5571和miR-615的表達(dá)水平及其與預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集100例經(jīng)術(shù)后病理診斷為肺腺癌病人的新鮮血液標(biāo)本（肺腺癌組），抽提血液中的總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測其miR-1293、miR-5571和miR-615的表達(dá)水平，并分析其與預(yù)后的相關(guān)性。以100例健康體檢者血液標(biāo)本作為對照組。結(jié)果 與對照組比較，肺腺癌組miR-1293和miR-615表達(dá)顯著增高，miR-5571表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.106～27.375，P<0.05）。Log-rank分析顯示，3種miRNA的表達(dá)均與肺腺癌病人的總生存率和無病生存率相關(guān)（χ2=18.357～19.620，P<0.05），其中miR-1293和miR-615表達(dá)水平越高，病人總生存率和無病生存率越低;miR-5571表達(dá)水平越高，病人總生存率和無病生存率越高。結(jié)論 miR-1293、miR-5571和miR-615在外周血中的表達(dá)水平可能成為肺腺癌病人預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng);循環(huán)微RNA;預(yù)后

[中圖分類號] R730.261 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）06-0636-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.173 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20201018.1635.001.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of miR-1293， miR-5571， and miR-615 in the blood of patients with lung adenocarcinoma and its association with prognosis. ?Methods A total of 100 fresh blood samples were collected from the patients who were diagnosed with lung adenocarcinoma by postoperative pathology （lung adenocarcinoma group） to extract total RNA of blood， and quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-1293， miR-5571， and miR-615 and analyze its association with prognosis. The blood samples collected from 100 healthy individuals were included in control group. ?ResultsCompared with the control group， the lung adenocarcinoma group had significant increases in the expression of miR-1293 and miR-615 and a significant reduction in the expression of miR-5571 （t=23.106-27.375，P<0.05）. The Log-rank analysis revealed that the expression of these three miRNAs was significantly correlated with the overall survival rate and disease-free survival rate of patients with lung adenocarcinoma （χ2=18.357-19.620，P<0.05）. The higher the expression of miR-1293 and miR-615， the shorter the overall survival time and the disease-free survival time; the higher the expression of miR-5571， the longer the overall survival time and the disease-free survival time. ?Conclusion The expression levels of miR-1293， miR-5571， and miR-615 in peripheral blood of patients with lung adenocarcinoma may become a marker for prognostic evaluation in patients with lung adenocarcinoma.

[KEY WORDS] adenocarcinoma of lung; real-time polymerase chain reaction; circulating microRNA; prognosis

肺腺癌是中國乃至全世界最常見的惡性腫瘤以及首位的癌癥死亡原因[1]。據(jù)估計(jì)，在全球范圍內(nèi)，癌癥相關(guān)死亡的27%以上由肺癌引發(fā)。特別是非小細(xì)胞肺癌是最常見的病理組織亞型[1]。盡管在外科治療、靶向性治療和早期癌癥檢測等方面取得了很大進(jìn)展，但肺腺癌的總生存率仍然不樂觀[2]。目前，細(xì)胞學(xué)篩查和影像檢查被證明是靈敏的癌癥篩查工具，但是對肺腺癌來說并未顯示出足夠有效的早期檢測能力[3-4]。因此，確定預(yù)后生物標(biāo)志物以準(zhǔn)確預(yù)測肺腺癌的臨床結(jié)局有重要意義。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展，多種具有潛在臨床價(jià)值的候選生物標(biāo)志物已被確定。研究表明，微小型RNA （miRNAs）是生物學(xué)和臨床特征的有用生物標(biāo)記物[5]。miRNAs是內(nèi)源性的、單鏈的、小的非編碼的RNAs（18～25個(gè)核苷酸）[6]。近年來大?量研究證實(shí)，miRNAs的異常表達(dá)參與了癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及與癌變有關(guān)的所有基本細(xì)胞過程[7]。miRNAs可能是癌癥診斷、預(yù)后評估和治療靶點(diǎn)的潛在標(biāo)志物。已有研究顯示，某些特異性miRNAs可預(yù)測肺腺癌病人的臨床結(jié)局，如miR-432、miR-210、miR-145、和miR-31等[8]。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，miR-1293、 miR-5571和miR-615在肺腺癌病人和健康對照組中表達(dá)有差異;但關(guān)于其能否預(yù)測肺腺癌病人預(yù)后目前尚未見報(bào)道。本研究收集100例肺腺癌病人外周血標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法檢測其miR-1293、miR-5571和miR-615表達(dá)，并分析其表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肺腺癌病人100例，為2013年6月—2017年6月在青島市市立醫(yī)院胸外科就診的病人，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。男41例，女59例，年齡40～71歲，平均（55.11±7.72）歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2013版腫瘤分類及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理分級為Ⅰ級5例，Ⅱ級10例，Ⅲ級17例，Ⅳ級68例。以同期該院健康體檢中心年齡及性別匹配的正常健康體檢者100例作為對照組。本研究獲得病人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

IQ5 Real-time PCR儀（Bio-Rad，Hercule，CA，USA）;Eppendorf離心機(jī)（Eppendorf，Hamburg，Germany）;Nanodrop 3000紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）;恒溫水浴鍋（上海凌科公司）。Trizol RNA提取試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）;Revert AidTM First Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司）;qPCR試劑盒（日本Takara公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本采集及處理 用EDTA抗凝管采集肺腺癌病人及對照組新鮮外周血3 mL，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用Trizol提取外周血清總RNA，Revert AidTM First Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，應(yīng)用莖環(huán)法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 qPCR檢測 采用SYBR Green熒光染料法，以cDNA為模板，在IQ5 Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。所有待檢測miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物及上游下游引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)與合成，見表1。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，內(nèi)含：cDNA模板0.5 μL，2×TaKaRa SYBR Premix Ex 12.5 μL，上游和下游引物各0.5 μL，以雙蒸水補(bǔ)足體系至25.0 μL。定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃合成40 s，循環(huán)40次。記錄循環(huán)閾值（Ct），采用2-△△Ct法計(jì)算miR-1293、miR-5571和miR-615的相對表達(dá)。以U6作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。預(yù)后比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 兩組miR-1293、 miR-5571和miR-615相對表達(dá)量比較

與對照組比較，肺腺癌組miR-1293和miR-615顯著增高，miR-5571顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.106～27.375，P<0.05）。見表2。

2.2 肺腺癌miR-1293、 miR-5571和miR-615相對表達(dá)量與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性

隨著肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、腫瘤分期和T分期升高，miR-1293的表達(dá)量顯著提高（t=2.254～2.819，P<0.05）;隨著肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期升高，miR-5571表達(dá)量顯著下降（t=2.287，P<0.05）。miR-615表達(dá)量與臨床病理學(xué)參數(shù)無關(guān)（P>0.05）。

2.3 miR-1293、miR-5571和miR-615表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性

分別以各指標(biāo)的平均表達(dá)量作為cut-off值，高于平均表達(dá)量定義為高表達(dá)，低于平均表達(dá)量定義為低表達(dá)。肺腺癌病人的外周血中miR-1293、miR-5571和miR-615的cut-off值分別為0.25、0.10和1.10。Long-rank分析顯示，肺腺癌miR-1293、miR-5571和miR-615表達(dá)均與總生存率、無病生存率有相關(guān)性（χ2=18.357～20.147，P<0.05）。其中miR-1293和miR-615表達(dá)水平越高，肺腺癌病人的總生存率和無病生存率越低;而miR-5571表達(dá)水平越高，病人的總生存率和無病生存率越高（圖1）。

3 討 ?論

越來越多的證據(jù)表明，特異性miRNA的異常表達(dá)參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展[7]。miRNA的異常表達(dá)直接影響其靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的增殖、分化以及遷移等惡性細(xì)胞學(xué)行為，從而使得miRNA成為肺癌的潛在治療靶標(biāo)[9]。盡管已有研究表明，一些肺癌相關(guān)的miRNA在肺癌與健康對照組織中表達(dá)差異有顯著意義，如miR-25-3p、miR-29c-3p、miR-33a-5p、miR-144-3p、miR-153-3p、miR-342-5p和miR-485-3p等[8]，但是miR-1293、miR-5571和miR-615在肺腺癌病人外周血中表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性目前尚未見報(bào)道。

miR-1293定位于染色體12q1312（ID100302220）。目前，有關(guān)hsa-miR-1293在癌癥中的作用研究較少[10-11]，未見miR-1293在肺癌中表達(dá)報(bào)道。miR-1293在癌癥中的生物學(xué)作用目前還存在爭議性，比如miR-1293在三陰性乳癌中起著抑癌基因的作用[11]，而在結(jié)直腸癌細(xì)胞中起癌基因作用，能夠促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤[10]，提示miR-1293作用可能有一定的組織依賴性。本文研究結(jié)果顯示，肺腺癌病人外周血中miR-1293表達(dá)較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;miR-1293表達(dá)與肺腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和T分期等有關(guān);miR-1293表達(dá)與肺腺癌病人總生存和無病生存有相關(guān)性，推測miR-1293在肺腺癌中可能起著類似癌基因的作用。

惡性腫瘤中miR-615最初發(fā)現(xiàn)來自間皮瘤[12]，其后在胰腺癌、乳癌、鼻咽癌、非小細(xì)胞型肺癌和前列腺癌等病人中均有報(bào)道[13-14]。miR-615在癌癥中的作用亦存在爭議，其生物學(xué)功能可能有一定的組織依賴性。有研究顯示，miR-615在非小細(xì)胞型肺癌中起著抑癌基因的作用，但是在胃癌中起著癌基因的作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，miR-615在肺腺癌病人外周血中表達(dá)顯著增高，并且其表達(dá)水平與病人不良預(yù)后（總生存率和無病生存率）有相關(guān)性，表明miR-615在肺腺癌中起癌基因的作用。

miR-5571位于染色體22q11，目前尚未見其在惡性腫瘤中表達(dá)的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌病人外周血中miR-5571表達(dá)較對照組顯著下降，推測miR-5571在肺腺癌中起著類似抑癌基因的作用。miR-5571表達(dá)的預(yù)后分析也支持該推測。

綜上所述，miR-1293、miR-5571和miR-615表達(dá)均與肺腺癌病人總生存率和無病生存率有相關(guān)性，本文結(jié)果提示miR-1293、miR-5571和miR-615在外周血中的表達(dá)水平可能成為肺腺癌病人預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）