鄧雅文，陳恒文，武慶娟，李軍

中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院 心血管科，北京 100053

心律失常(cardiac arrhythmia)是心血管疾病中重要的一組疾病，多因心臟活動的起源和(或)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動的頻率和(或)節(jié)律異常而誘發(fā)，主要表現(xiàn)為心悸、氣短、頭暈乏力等癥狀，還可引起冠狀動脈、腦動脈和腎動脈供血不足[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球發(fā)生心源性猝死的人數(shù)超過700萬，約占總死亡人數(shù)的25%[2]。在我國，心律失常的患者已超過2千萬[3]，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前心律失常的西醫(yī)治療仍以藥物治療為主，體外電復(fù)律和電除顫及射頻消融術(shù)等非藥物療法的不斷發(fā)展給患者帶來更多治療選擇，同時也帶來了藥物不良反應(yīng)和術(shù)后并發(fā)癥等諸多問題；而傳統(tǒng)的中醫(yī)藥注重“整體觀”和“辨證施治”，具有不良反應(yīng)較小，患者依從性相對較高等特點，對心律失常的患者的療效越來越受到重視，特別是以甘松為主的抗心律失常的中藥及其復(fù)方(參松養(yǎng)心膠囊和穩(wěn)心顆粒等)在臨床上廣泛使用，取得了較為滿意的臨床效果。

甘松為敗醬科植物甘松和匙葉甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根莖及根，主產(chǎn)于我國四川、云南和西藏等地。其味辛、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)；具有理氣止痛、開郁醒脾、外用祛濕消腫等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明,甘松有抗癲癇、抗驚厥、抗抑郁、抗瘧、抑菌、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗焦慮、改善血糖代謝等作用[4]。甘松主要成分包括萜類、黃酮類及酚類等[5]。一般認(rèn)為當(dāng)歸素(angelicin)、甘松新酮(nardosinone)、甘松香酮A(kanshone A)和甘松香酮B(kanshone B)、甘松新酮二醇等為其主要有效活性成分[6-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)科基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)有的藥理學(xué)基礎(chǔ)，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設(shè)計的一門新學(xué)科[9-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅能揭示更復(fù)雜的藥理學(xué)規(guī)律，更是從整體的角度對藥物與疾病間的奧秘進行了探索。從系統(tǒng)性、整體性的方法學(xué)特點來說，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥“整體觀念”“辨證論治”的哲學(xué)思想不謀而合。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測并篩選甘松干預(yù)心律失常的重要成分及其作用靶點，探討甘松對心律失?？赡艿母深A(yù)機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[11](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、ETCM數(shù)據(jù)庫[12](http：//www.nrc. ac.cn：9090/ETCM/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫[13](http：//tcmspw.com/)收集甘松化學(xué)成分；TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)收集心律失常疾病相關(guān)靶點；重要成分對應(yīng)靶點用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測；Venny在線網(wǎng)絡(luò)獲得成分交集及靶點交集；STRING version 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點與相關(guān)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析；FunRich version 3.13軟件進行甘松基因靶點富集網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析；靶點通路富集注釋網(wǎng)絡(luò)用KEGG在線平臺分析并繪制。利用Cytoscape version 3.7.2軟件構(gòu)建成分靶點可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.2 甘松的化學(xué)成分收集及重要成分篩選

通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫和TCMSP數(shù)據(jù)庫，基于不同的計算機算法對中藥“甘松”進行檢索，收集甘松化學(xué)成分，將結(jié)果進行匯總。將篩選得到3個數(shù)據(jù)庫共有的甘松化學(xué)成分作為其重要化學(xué)成分。

1.3 甘松化學(xué)成分靶點篩選

借助BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，基于產(chǎn)物相似、靶點相近、交叉驗證的工作原理對甘松重要成分的靶點進行預(yù)測。

1.4 心律失常疾病相關(guān)靶點及甘松治療心律失常疾病作用靶點篩選

在TTD數(shù)據(jù)庫、GeneCads數(shù)據(jù)庫中通過檢索關(guān)鍵詞“cardiac arrhythmia”獲得心律失常疾病相關(guān)靶點；靶點名稱均選擇UniprotKB提供的基因簡稱；將甘松重要成分所對應(yīng)的預(yù)測靶點與心律失常疾病相關(guān)靶點進行映射，借助在線韋恩圖直觀讀取并分析得到甘松治療心律失常的作用靶點。

1.5 甘松治療心律失常的重要成分-預(yù)測靶點可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將甘松重要化學(xué)成分名稱與其對應(yīng)的預(yù)測靶點通過Microsoft Excel表格進行數(shù)據(jù)編排，分別導(dǎo)入基于JAVA 8.0環(huán)境工作變量的Cytoscape version 3.7.2計算機可視化軟件中，構(gòu)建甘松重要成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將基于公共數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站獲取的甘松治療心律失常的作用靶點上傳到STRING蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫“Multiple proteins”的功能框，選擇人種為“Home sapiens”后獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。如因靶點太少沒有產(chǎn)生相關(guān)連接蛋白，可通過一次或幾次的擴展獲取關(guān)聯(lián)蛋白。

1.7 GO富集注釋分析及KEGG通路分析

運用FunRich version 3.1.3軟件工具[14]，對關(guān)鍵靶點進行GO富集注釋。該軟件可以加載Gene Ontology數(shù)據(jù)庫，建立甘松的關(guān)鍵靶點datasets后，選擇Gene Ontology Functional Term 3組內(nèi)容(生物學(xué)過程、細(xì)胞組分或分子功能)任一組，從中選擇合適的圖表。將甘松治療心律失常的人源關(guān)鍵靶點導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫進行可能的靶點通路富集情況檢索，并繪制甘松治療心律失常的作用機制通路圖。

2 結(jié)果

2.1 甘松化學(xué)成分

采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索“GAN SONG”，靶點參數(shù)設(shè)置為“Score cutoff=20”，獲得63個化合物，其中24個無結(jié)構(gòu)信息，故予以排除，得到39個甘松化學(xué)成分。經(jīng)ETCM數(shù)據(jù)庫檢索“甘松”，獲得38個成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索“甘松”獲得57個化學(xué)成分。除去重復(fù)成分，共得到108個甘松化學(xué)成分，見圖1。

圖1 不同數(shù)據(jù)庫獲取甘松化學(xué)成分的韋恩圖

2.2 甘松重要成分及對應(yīng)靶點

從TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中得到9個共有成分，作為甘松的重要成分，見表1。采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對9個重要成分所對應(yīng)的靶點進行了預(yù)測，設(shè)置參數(shù)P-value為0.05(默認(rèn)值)，經(jīng)去重后得到預(yù)測靶點198個，見表1。

表1 甘松重要成分信息

續(xù)表1

2.3 心律失常疾病相關(guān)靶點及甘松作用靶點

以“cardiac arrhythmia”為關(guān)鍵詞分別在Genecards和TTD數(shù)據(jù)庫檢索心律失常相關(guān)疾病靶點。獲得GeneCards數(shù)據(jù)庫中心律失常疾病相關(guān)靶點13個，TTD數(shù)據(jù)庫中心律失常疾病相關(guān)靶點8個，除去重復(fù)疾病相關(guān)靶點，心律失常疾病相關(guān)靶點共19個。將甘松預(yù)測靶點與心律失常疾病靶點進行映射，取交集，得到甘松治療心律失常作用靶點4個，分別為ADORA1、KCNQ1、KL、CAT，見圖2。

圖2 甘松預(yù)測靶點與疾病靶點共有作用靶點韋恩圖

2.4 甘松治療心律失常重要成分-預(yù)測靶點可視化網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape version 3.7.2軟件中導(dǎo)入甘松重要成分和預(yù)測靶點數(shù)據(jù)表，生成甘松治療心律失常的重要成分-預(yù)測靶點可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖3。根據(jù)疾病靶點-共同靶點-預(yù)測靶點數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

上傳甘松的4個作用靶點到STRING在線蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中，發(fā)現(xiàn)作用靶點較少，無法生成相關(guān)蛋白質(zhì)之間連接，需要擴展靶點。通過2次擴展后，得到除4個作用靶點之外的10個關(guān)聯(lián)靶蛋白，分別是GSR、SOD1、SOD2、SOD3、GNAI2、KCNE3、KCNE2、KCNE1、AKAP9、FGF23。因此，共14個靶蛋白作為關(guān)鍵靶蛋白，見圖5。

2.6 GO富集分析

通過PPI分析擴展得到的14個關(guān)鍵靶蛋白，加載到FunRich軟件中Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行GO Term富集分析。其中，生物學(xué)過程條目(biological process)160條，分子功能(molecular function)條目26條，細(xì)胞組分(cellular component)條目26條。在生物學(xué)過程方面中，根據(jù)P<0.001選擇顯著性富集條目有：心室肌細(xì)胞膜復(fù)極的調(diào)節(jié)(regulation of ventricular cardiac muscle cell membrane repolarization)、膜復(fù)極參與動作電位的調(diào)節(jié)(membrane repolarization during ventricular cardiac muscle cell action potential)、心肌收縮的調(diào)節(jié)(regulation of cardiac muscle contraction)、心室心肌細(xì)胞動作電位的膜復(fù)極(GO：0098915)、鉀離子跨膜外輸(GO：0097623)等，見圖6。

在分子功能方面中，根據(jù)P<0.001篩選最顯著富集的條目有5條，包括電壓門控鉀通道活性與心室肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化(GO：1902282)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity)、延遲整流鉀通道活性(delayed rectifier potassium channel activity)、鉀通道調(diào)節(jié)活動(potassium channel regulator activity)和離子通道結(jié)合(ion channel binding)，見圖7。在細(xì)胞組分方面，以P<0.001篩選顯著性條目只有電壓門控鉀通道復(fù)合體(voltage-gated potassium channel complex)條目，見圖8。

注：菱形代表重要成分；三角形代表對應(yīng)的預(yù)測靶點；紅色菱形代表含有對應(yīng)靶點的重要成分；淡綠色菱形代表沒有對應(yīng)靶點的重要成分；深灰色三角形代表預(yù)測靶點。圖3 甘松重要成分與預(yù)測靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)

注：淺藍色圓形代表靶點；數(shù)字1所連接的區(qū)域代表疾病靶點；數(shù)字2連接的區(qū)域代表共同靶點；數(shù)字3連接的區(qū)域代表預(yù)測的靶點。圖4 疾病靶點-共同作用靶點-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

注：節(jié)點代表靶蛋白；邊代表功能相關(guān)性；藍色線條代表共存證據(jù)；紫色線條代表有實驗證據(jù)；黃色線條代表文本挖掘；黑色線條代表共表達的數(shù)據(jù)。圖5 甘松治療心律失常作用PPI網(wǎng)絡(luò)

圖7 甘松治療心律失常的分子功能富集分析

圖8 甘松治療心律失常的細(xì)胞組分富集分析

2.7 甘松治療心律失常的關(guān)鍵靶蛋白KEGG通路分析

依據(jù)靶點富集在通路的個數(shù)和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)確定甘松治療心律失常可能的KEGG通路有17條，主要涉及過氧化酶(peroxisome)、長壽相關(guān)通路(longevity regulating pathway)、心肌細(xì)胞腎素能信號(adrenergic signaling in cardiomyocytes)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等(見表2)。選擇其中過氧化酶、心肌細(xì)胞腎素能信號通路進行繪制，見圖9～10。

表2 甘松治療心律失常的關(guān)鍵靶點KEGG分析(17條)

續(xù)表2

注：白色節(jié)點代表信號通路蛋白；紅色代表甘松的關(guān)鍵靶點蛋白。圖9 甘松治療心律失常的主要通路——過氧化酶

注：白色節(jié)點代表通路蛋白；紅色代表甘松的關(guān)鍵作用靶蛋白；實線箭頭代表直接關(guān)系；虛線箭頭代表間接關(guān)系。圖10 甘松治療心律失常的主要通路——心肌細(xì)胞腎素能信號通路

3 討論

甘松始載于唐代《本草拾遺》，從1963年正式收入《中華人民共和國藥典》，具有芳香開竅、行氣解郁的功效。據(jù)《本草綱目》記載，甘松“甘，溫，無毒，主治惡氣、卒心腹痛滿、下氣”，說明甘松能解久病之郁滯，能入心經(jīng)，具有安心、養(yǎng)血和定悸的功效。甘松藥性溫而不燥，味甘，具有開郁醒脾、理氣止痛之功，還能調(diào)節(jié)脾胃升降之機，具有補而不滯的功效。現(xiàn)代藥理研究顯示，甘松具有抗焦慮、抗心律失常、抗抑郁、抗氧化、改善心肌缺血、調(diào)節(jié)血壓、改善血糖代謝及減少消化性潰瘍面積等諸多功效。臨床應(yīng)用中，甘松常被用于治療心血管疾病和消化系統(tǒng)疾病。市場上常見的穩(wěn)心顆粒、參松養(yǎng)心膠囊，其中的主要組分就包含甘松。目前從甘松中分離提取的化合物按化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分為萜類、黃酮類、香豆素和木脂素類、揮發(fā)油、糖類、無機元素及其他類[14]，其中以萜類化合物含量較高，具有較好的藥用價值。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版[4]對甘松的記載，甘松新酮是甘松干燥品的最具代表性成分。甘松化學(xué)成分復(fù)雜，目前其抗心律失常的作用機制尚不清楚。因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初步研究甘松抗心律失常的作用機制具有重要意義。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索甘松的化學(xué)成分，并對核心交集成分進行靶點預(yù)測，將作用靶點經(jīng)蛋白互作擴展后得到的關(guān)鍵靶蛋白進行GO分析和KEGG通路分析，并對甘松抗心律失常的靶點機制進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。本研究檢索得到甘松的9個重要成分，對重要成分的對應(yīng)靶點進行預(yù)測，去除成分中相同的靶點后得到198個預(yù)測靶點。將預(yù)測靶點映射心律失常疾病靶點，得到甘松抗心律失常的作用靶點是ADORA1、KCNQ1、KL和CAT。對甘松抗心律失常作用靶點進行PPI分析，通過擴展靶點共得到14個關(guān)鍵靶點蛋白，并進行GO-Term富集分析。甘松抗心律失常作用在生物學(xué)過程方面，與心室肌細(xì)胞膜復(fù)極的調(diào)節(jié)、心室肌細(xì)胞動作電位中的膜復(fù)極、延遲整流鉀通道活性、鉀離子跨膜外輸顯著相關(guān)；分子功能方面與電壓門控鉀通道活性與心室肌細(xì)胞動作電位復(fù)極的關(guān)系、超氧化物歧化酶活性、延遲整流鉀通道活性、鉀通道調(diào)節(jié)活性功能顯著相關(guān)；細(xì)胞組分方面與電壓門控鉀通道復(fù)合體顯著相關(guān)。通過KEGG分析得到甘松預(yù)測靶點的17條通路，涉及了過氧化酶、長壽通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素信號通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的脂解作用信號通路、胃酸分泌、Foxo信號通路、cGMP-PKG信號通路、Rap1信號通路、cAMP信號通路等。

基因表型及基因突變在遺傳性心律失常疾病中具有十分重要的意義。已知研究顯示，ADORA1又名腺苷A1受體，是G-蛋白偶聯(lián)受體。A1受體激活抑制腺苷環(huán)化酶，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，誘導(dǎo)鉀離子通道的開放，從而間接降低鈣離子進入細(xì)胞的滲透能力。腺苷能減慢竇性心律，尤其是房室傳導(dǎo)，有減慢心率的作用(A1作用)，可用于治療室上性心動過速。其作用是誘導(dǎo)鉀離子通道的開放，允許鉀離子流出，從而增加細(xì)胞極化，并能降低缺血再灌注后造成的心肌損傷。由KCNQ1蛋白組成的通道主要存在于內(nèi)耳和心肌中。在心臟組織中，這些通道在每次心跳后都參與心肌充電，使其保持有規(guī)律的節(jié)奏。KCNQ1基因突變與長QT綜合征關(guān)系密切，有研究[15]發(fā)現(xiàn)KCNQ1基因突變易導(dǎo)致輕度I通道功能障礙，攜帶KCNQ1基因突變的患者發(fā)生嚴(yán)重心律失常和猝死的風(fēng)險較一般正常人高?；诖?，甘松的靶點預(yù)測對相關(guān)新藥開發(fā)有一定的參考價值。目前僅有文獻報道甘松抗心律失?？赡芘c環(huán)磷酸腺苷(cAMP)有關(guān)，但其他通路還待進一步發(fā)現(xiàn)和實驗確證。cAMP是一種環(huán)狀核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，使cAMP底物蛋白磷酸化，從而加速對鈣的攝取和轉(zhuǎn)運。該信號通路作為重要的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是通過腺苷酸環(huán)化酶活性的變化來調(diào)節(jié)靶細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP的水平，進而影響細(xì)胞代謝行為等下游事件[16-17]。簡鵬等[18]通過對大鼠腹腔內(nèi)注射甘松主要活性成分甘松新酮，選用激光共聚焦顯微鏡測量心肌細(xì)胞鈣離子變化，用凝膠成像法檢測cAMP及PKA的變化，發(fā)現(xiàn)甘松新酮能明顯抑制心肌細(xì)胞鈣離子超載，促進心功能恢復(fù)，預(yù)測甘松新酮可能是通過影響cAMP-PKA細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來起作用的。

綜上，本研究預(yù)測的靶點與已知文獻報道的甘松治療心律失常的作用基本吻合，體現(xiàn)了靶點預(yù)測的準(zhǔn)確性，同時揭示了甘松多成分、多靶點、多途徑作用的特點。目前有關(guān)甘松作用靶點、抗心律失常機制層面的研究報道較少，還需后續(xù)更多實驗的驗證。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可為今后深入研究甘松干預(yù)心律失常的分子機制提供一定的參考。