李討討，王霞，馬友記,2，尹德恩，張勇，趙興緒

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2甘肅肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅民勤 733300；3甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

0 引言

【研究意義】藏綿羊作為我國(guó)三大原始綿羊品種之一，是分布于海拔3 000 m以上的青藏高原及其毗鄰地區(qū)種群數(shù)量最多的家畜[1]，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民提供了極其重要的生活物資和經(jīng)濟(jì)收入，并在高寒草甸草地生物多樣性及生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。但由于藏綿羊所具有的發(fā)育周期長(zhǎng)、繁殖力低下、性成熟晚等繁殖生理特點(diǎn)，嚴(yán)重制約了其種群的數(shù)量。目前有關(guān)雄性藏綿羊睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的分子生物學(xué)認(rèn)識(shí)仍十分匱乏。睪丸作為維持雄性動(dòng)物生殖能力的最關(guān)鍵器官，主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生雄性配子（精子），而精子發(fā)生是精子產(chǎn)生所必需的發(fā)育過(guò)程，其有序運(yùn)行是雄性生殖系統(tǒng)建立和維持的前提保障[2]。精子發(fā)生過(guò)程受到許多基因在多個(gè)層面（表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等）的精密調(diào)控[3-4]。研究精子發(fā)生相關(guān)基因在藏綿羊睪丸發(fā)育及精子發(fā)生中的表達(dá)特征及調(diào)控作用，對(duì)于理解綿羊及其他高原動(dòng)物睪丸功能維持的分子調(diào)控機(jī)理具有重要科學(xué)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BOLL（也稱(chēng)BOULE）作為無(wú)精癥缺失（Deleted in Azoospermia，DAZ）基因家族中最古老的成員，目前已被廣泛報(bào)道特異性存在于從昆蟲(chóng)至哺乳動(dòng)物的性腺中，并且主要在雄性動(dòng)物睪丸中表達(dá)，如鋸蠅[5]、果蠅[6]、虹鱒[7]、雞[8]、小鼠[9]、地鼠[10]、山羊[11]、牛（黃牛、牦牛、犏牛）[12]、獼猴[13]、人[14-16]等。在睪丸發(fā)育期間，BOLL在精子發(fā)生（尤其減數(shù)分裂階段）中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，當(dāng)其表達(dá)缺失或功能異常時(shí)，可導(dǎo)致精子發(fā)生過(guò)程停滯，從而因精子生成障礙而造成精液品質(zhì)不良甚至雄性不育。在BOLL缺失或突變的人和果蠅睪丸中均表現(xiàn)出減數(shù)分裂紊亂和停滯，進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)精癥，并且人的BOLL可以挽救果蠅睪丸中BOLL缺失導(dǎo)致的減數(shù)分裂缺陷[14,17]，提示BOLL在昆蟲(chóng)和人上具有類(lèi)似的減數(shù)分裂調(diào)控作用。反之，在無(wú)精癥患者睪丸中，也發(fā)現(xiàn)BOLL的表達(dá)顯著降低，并且隨著睪丸功能衰竭程度的加深其降低程度愈發(fā)明顯[18]。在小鼠中，BOLL缺失的睪丸體積明顯縮小，雖然精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程可以正常進(jìn)行，但減數(shù)分裂產(chǎn)生的圓形精細(xì)胞喪失進(jìn)一步發(fā)育為成熟精子的能力[9]，表明BOLL在精子發(fā)生階段的調(diào)控作用因物種而異。此外，在人原始生殖細(xì)胞中BOLL的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成從而進(jìn)入減數(shù)分裂階段，形成在細(xì)胞形態(tài)上類(lèi)似于圓形精細(xì)胞的單倍體生殖細(xì)胞[15]。與之相類(lèi)似，在奶山羊雄性生殖干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BOLL也可啟動(dòng)并促進(jìn)其減數(shù)分裂進(jìn)程[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前研究表明，BOLL盡管在雄性動(dòng)物的精子發(fā)生過(guò)程中扮演不可或缺的角色，且在很多物種精子發(fā)生的減數(shù)分裂階段起關(guān)鍵調(diào)控作用，但不難發(fā)現(xiàn)，其所執(zhí)行的生物學(xué)功能因物種的不同存在差異，并且目前在藏綿羊睪丸中有關(guān)BOLL的序列特征、表達(dá)模式及調(diào)控作用尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以藏綿羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在解讀BOLL的分子特征及在綿羊睪丸發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)與分布規(guī)律，進(jìn)而探究其表達(dá)調(diào)控作用及所賦予的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步探索BOLL在綿羊乃至其他哺乳動(dòng)物睪丸中的時(shí)空表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及在精子發(fā)生中的作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年3月至2020年8月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

以甘肅省夏河甘加藏羊養(yǎng)殖合作社提供的 24只健康雄性藏綿羊（同父異母）作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)羊來(lái)自相同父本，不同母本，分為3個(gè)發(fā)育階段：性成熟前（3月齡，n=8）、性成熟（1歲齡，n=8）和成年（3 歲齡，n=8）。所有羊只在海拔 3 000—3 500 m的天然草場(chǎng)圍欄放牧，晝夜自由采食，無(wú)補(bǔ)飼。屠宰后收集每只綿羊的右側(cè)睪丸組織，一部分液氮速凍后存放于-80 ℃，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定用于制作石蠟切片。

1.2 總RNA提取及質(zhì)檢

冷凍的各睪丸組織經(jīng)液氮快速研磨后，使用Trizol試劑盒（全式金生物公司, 北京）進(jìn)行總RNA提取；使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)（德國(guó)）對(duì)提取的 RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。選取 OD260/OD280介于1.8—2.1，OD260/OD230大于2.0的RNA樣品，并經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其完整性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 第一鏈cDNA的合成

以質(zhì)量和濃度檢測(cè)合格的RNA樣品作為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR，艾克瑞，湖南）的操作說(shuō)明合成第一鏈cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取綿羊BOLL（XM_004004798.4）和β-actin（NM_001009784.2）的核苷酸序列，隨后利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物并送至擎科生物公司（西安）進(jìn)行合成。

1.5 BOLL的克隆

以合成的cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行BOLLCDS區(qū)的擴(kuò)增。擴(kuò)增總反應(yīng)體系為 50 μL：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix（全式金生物公司，北京）25 μL，PCR Stimulant 10 μL（全式金生物公司，北京），模板 1 μL，上下游引物（BOLL-F：5′-ATG GAGACCGAGTCCGGG-3′，BOLL-R：5′-TTAATAAT GAATGCTCCACAC-3′）各 2 μL， ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 °C 5 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min。對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒對(duì)目的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并回收，隨后與pEASY-Blunt載體相連并轉(zhuǎn)化Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取8個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆通過(guò)菌落PCR法鑒定后，由擎科生物公司（西安）進(jìn)行測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用BLAST工具將獲得的藏綿羊BOLL序列與NCBI中現(xiàn)有的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以確定最近的親緣關(guān)系和序列相似度，并用 DNAMAN 8.0軟件對(duì)不同物種 BOLL的氨基酸序列同源性進(jìn)行比較。使用NCBI中的ORFfinder在線(xiàn)工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)藏綿羊CDS區(qū)所有開(kāi)放閱讀框（ORF）進(jìn)行查找分析。分別利用 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 Phyre 2.0（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）在線(xiàn)軟件對(duì)藏綿羊BOLL蛋白的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用 WebLogo 在線(xiàn)工具（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對(duì)結(jié)構(gòu)域區(qū)段的核苷酸和氨基酸序列保守性進(jìn)行分析。該蛋白的跨膜區(qū)和信號(hào)肽區(qū)分別通過(guò) TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0）和 SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.0/）軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用鄰接算法通過(guò)MEGA 7.0軟件構(gòu)建BOLL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用 STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://stringdb.org）對(duì)與綿羊BOLL蛋白相互作用的潛在蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，并使用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化。

1.7 qRT-PCR 分析

采用qRT-PCR技術(shù)在羅氏LightCycler 96熒光定量PCR儀（瑞士）上對(duì)各年齡組睪丸中BOLLmRNA的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參。采用兩步法反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA, 每 0.4 μL上下游引物（表 1），10 μL 2×SYBR GreenPro TaqHS Premix（艾克瑞，湖南），補(bǔ)充ddH2O至20 μL。每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information used for qRT-PCR

1.8 Western blot 檢測(cè)

使用含PMSF的RIPA裂解液（索萊寶生物公司,北京）提取各睪丸組織總蛋白，BCA試劑盒（碧云天生物公司，上海）對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定，并經(jīng) 5×SDS上樣緩沖液（索萊寶生物公司，北京）變性后，用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，并經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h后，用一抗BOLL（稀釋比1∶500；博奧森，北京）或β-actin（稀釋比1∶1 500；博奧森，北京）4 ℃孵育過(guò)夜。0.1% PBST洗膜后，添加山羊抗兔二抗（稀釋比1∶5 000；博奧森，北京）孵育2 h。使用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、曝光和顯影。用AlphaEaseFC軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化，并對(duì)BOLL蛋白的相對(duì)表達(dá)豐度進(jìn)行計(jì)算。

1.9 免疫熒光染色

使用常規(guī)方法對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇脫水后，用微波爐加熱法加入EDTA抗原修復(fù)緩沖液對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)。5%BSA室溫封閉30 min后，添加一抗 BOLL（1∶200；博奧森，北京）4 ℃孵育過(guò)夜。同時(shí)用5%BSA代替一抗BOLL作為陰性對(duì)照。PBS清洗后，切片中滴加帶有FITC綠色熒光標(biāo)簽的山羊抗兔二抗（稀釋比1∶200；賽維爾，武漢），室溫避光孵育1 h。PBS沖洗后，DAPI核染10 min，用含抗熒光猝滅劑的溶液封片，熒光顯微鏡（尼康，日本）觀察并拍照。

1.10 綿羊BOLL的功能注釋與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

利用非冗余蛋白質(zhì)（NR）數(shù)據(jù)庫(kù)和基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)綿羊BOLL所參與的生物學(xué)過(guò)程或功能進(jìn)行注釋?；谡n題組前期通過(guò) RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)獲得的藏綿羊睪丸組織全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用 RNAhybrid 2.1.2（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld）+SVM_light 6.01（http://svmlight.joachims.org/），Miranda 3.3a（http://www.microrna.org/microrna/home）和 TargetScan 7.0（http://www.targetscan.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在的調(diào)控BOLL的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）/環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）-微小 RNA（microRNA，miRNA）-BOLL作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并對(duì)上述數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集作為 ceRNA整合分析結(jié)果，使用 Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.11 潛在靶向調(diào)控BOLL的miRNAs及ceRNAs表達(dá)量驗(yàn)證

對(duì)通過(guò)上述 ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析獲得的潛在調(diào)控BOLL的lncRNAs、circRNAs和miRNAs表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，并與RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比較。以1.2中提取的總RNA為模板，根據(jù)Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR（艾克瑞，湖南）和Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明分別合成用于 lncRNA/circRNA和miRNA qRT-PCR擴(kuò)增的第一鏈cDNA。qRT-PCR操作方法同1.7所述。運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)lncRNA引物和circRNA發(fā)散引物，并經(jīng)Blast對(duì)其特異性檢測(cè)；采用加尾法設(shè)計(jì)miRNA的上游引物。引物（表1）均由擎科生物公司（西安）進(jìn)行合成。每個(gè)樣本設(shè)計(jì) 3個(gè)重復(fù)。分別以β-actin和 U6作為內(nèi)參對(duì)lncRNA/circRNA和miRNA的表達(dá)量進(jìn)行校正。

1.12 熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建及雙熒光素酶活性檢測(cè)

將分別含有 oar-miR-760-3p、oar-miR-127-5p和oar-miR-382-5p假定靶結(jié)合位點(diǎn)的綿羊源BOLL3′UTR區(qū)序列（XM_004004798.4），即BOLL-m760-3′UTR WT（核苷酸位點(diǎn) 1539-1843）、BOLL-m127-3′UTR WT（核苷酸位點(diǎn) 1599-1918）和 BOLL-m382-3′UTR WT（核苷酸位點(diǎn) 2430-2769）；含有 oar-miR-760-3p假定靶結(jié)合位點(diǎn)的circ-SPHKAP、Circ-ECT2L、LOC105602204（XR_001020768，核苷酸位點(diǎn) 16-325）、LOC105603195（XR_001022217，核苷酸位點(diǎn)50-369）和 LOC105616228（XR_001043211，核苷酸位點(diǎn)190-494）野生型序列；以及它們分別對(duì)應(yīng)的突變型（MUT）序列克隆至pmirGLO雙熒光素酶miRNA靶向表達(dá)載體（Promega, 美國(guó)）的XhoI和SalI位點(diǎn)。上述序列均由金唯智生物科技有限公司（蘇州）合成。miR-760-3p、miR-127-5p和 miR-382-5p的模擬物（mimic）及其陰性對(duì)照物（mimic NC）由吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）合成。復(fù)蘇購(gòu)自北京北納生物的 HEK-293T細(xì)胞，以 1.0×105/孔的密度接種于 24孔板中，使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃恒溫箱靜置培養(yǎng)24 h后（匯合率為70%—80%），采用 LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen, 美國(guó)），按照操作說(shuō)明將構(gòu)建的野生型及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體分別與對(duì)應(yīng)的mimics或 mimic NC 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。48 h 后收集細(xì)胞，采用 E1910雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega, 美國(guó)）分析相對(duì)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎素?zé)晒馑孛富钚缘谋戎祦?lái)表示。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采 用 2–ΔΔCt法 （ ΔCt=CtmRNAcircRNA/lncRNA/miRNACtβ-actin/U6）對(duì) qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。用 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用 Duncan多重檢驗(yàn)比較各組間的差異，P＜0.05和P＜0.01分別表示組間差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 藏綿羊BOLL完整CDS區(qū)序列特征

綿羊BOLL位于2號(hào)常染色體上，總長(zhǎng)為63 155 bp，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成（圖1-A）。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增的cDNA片段大小位于預(yù)期位置（圖1-B）。對(duì)該cDNA片段進(jìn)行克隆并測(cè)序，獲得了長(zhǎng)度為888 bp的核苷酸序列，對(duì)應(yīng)的序列信息已提交至 GenBank（Accession No. MT424763）。經(jīng)與NCBI中的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast檢索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與設(shè)計(jì)克隆引物所用綿羊BOLLCDS區(qū)序列（XM_004004798.4）完全一致。該克隆序列存在14個(gè)ORF，其中全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框ORF1（即完整CDS區(qū)）為888 bp，可編碼295個(gè)氨基酸（圖1-C、D）。藏綿羊BOLL編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)（pI）和分子式分別為32.43 kD、6.07和C1459H2217N379O440S10。該蛋白序列不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。

2.2 藏綿羊與其他哺乳動(dòng)物BOLL的同源性比較和結(jié)構(gòu)域分析

不同哺乳動(dòng)物BOLL的氨基酸序列多重比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)：藏綿羊與山羊的序列相似度最高（100%），其次為川南山地黃牛（99.66%）、牦牛（99.66%）、水牛（98.98%）、威德海豹（98.31%）、白尾鹿（97.97%）、非洲象（97.97%）、家貓（97.63%）、單峰駝（97.29%）、瘤牛（97.29%）、雙峰駝（97.29%）、灰熊（96.95%）、北極熊（96.95%）、家馬（96.95%）、野豬（96.95%）、北海獅（96.61%）、家犬（96.27%）和抹香鯨（95.93%），與兔的序列相似度最低（94.92%）（圖2-A）。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，在藏綿羊 BOLL氨基酸序列靠近 N端43—123位點(diǎn)處（核苷酸序列位點(diǎn)127—369）和172—196處（核苷酸序列位點(diǎn)514—588）分別存在RNA識(shí)別基序（RNA recognition motif，RRM）結(jié)構(gòu)域和DAZ重復(fù)基序，并且對(duì)應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列在不同哺乳動(dòng)物間具有高度保守性（圖2-B—E）。用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)來(lái)自20種哺乳動(dòng)物的BOLL氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，藏綿羊與山羊聚為一支，在進(jìn)化上與山羊、水牛、牦牛和川南山地黃牛的親緣關(guān)系較近，這與氨基酸同源性比較結(jié)果基本一致（圖3）。

圖1 藏綿羊BOLL CDS區(qū)克隆及序列分析Fig. 1 Cloning and sequence analysis of Tibetan sheep BOLL CDS region

圖2 不同哺乳動(dòng)物BOLL CDS區(qū)序列特征比較分析Fig. 2 Comparative analysis of BOLL CDS sequence features among different mammals

圖3 基于鄰接算法的BOLL蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree for amino acid sequences of BOLL protein based on Neighbor-joining algorithm

2.3 藏綿羊BOLL蛋白空間結(jié)構(gòu)分析

藏綿羊BOLL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)組成，分別占64.07%、18.64%、13.56%和3.73%（圖 4-A）。BOLL蛋白的三級(jí)分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成相似，主要含無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)類(lèi)型（圖4-B）。

2.4 與綿羊BOLL蛋白互作蛋白分析

由蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（圖 5）可知，綿羊BOLL編碼蛋白與10個(gè)蛋白可能存在相互作用，包括細(xì)胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白 1（CPEB1）、細(xì)胞分裂周期蛋白 25A（CDC25A）、細(xì)胞分裂周期蛋白20B（CDC20B）、DEAD家族的RNA解螺旋酶4（DDX4，也稱(chēng)VASA）、生長(zhǎng)抑制蛋白家族成員2（ING2）、RNA結(jié)合基序蛋白25（RBM25）、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（KPNA2）、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7（KPNA7）、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶 2（OAZ2）、泛素樣修飾活化酶 5（UBA5）。BOLL蛋白處于網(wǎng)絡(luò)核心位置，且與CPEB1、UBA5和CDC20B蛋白間的相互作用具有更高的可信度。

2.5 BOLL的表達(dá)模式

由圖6可知：在mRNA和蛋白質(zhì)水平，3月齡藏綿羊睪丸中BOLL表達(dá)量均較低；與3月齡相比，1歲齡和3歲齡睪丸中的BOLL mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01）；相比1歲齡，3歲齡睪丸中BOLLmRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，而蛋白呈現(xiàn)一定的下調(diào)趨勢(shì)。

圖4 藏綿羊BOLL蛋白的空間結(jié)構(gòu)Fig. 4 Spatial structure of Tibetan sheep BOLL protein

圖5 與綿羊BOLL蛋白互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 5 Network analysis of the proteins interacting with ovine BOLL protein

2.6 BOLL蛋白的免疫熒光染色

由BOLL蛋白的陽(yáng)性免疫染色結(jié)果（圖7）可知：在3月齡藏綿羊睪丸中，較弱的BOLL蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于部分精原細(xì)胞；在1歲齡和3歲齡睪丸中，強(qiáng)的BOLL蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要定位于長(zhǎng)形精細(xì)胞中，其次為圓形精細(xì)胞，也有較弱的陽(yáng)性信號(hào)被發(fā)現(xiàn)存在于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中，并且隨著年齡的增加，在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度減弱。

2.7 綿羊BOLL潛在的ceRNA表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及功能注釋

通過(guò)對(duì)BOLL的功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在分子功能方面，其主要涉及結(jié)合、翻譯調(diào)節(jié)活性等；在生物學(xué)過(guò)程方面，其主要參與組織細(xì)胞發(fā)育、生殖、配子生成、基因轉(zhuǎn)錄后及翻譯起始調(diào)控等過(guò)程（圖8）。ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)：綿羊BOLL受到3個(gè)潛在的miRNAs（oar-miR-127-5p、oar-miR-760-3p 和 oar-miR-382-5p）靶向調(diào)控，并且 3個(gè) lncRNAs（LOC105602204、LOC105603195和 LOC105616228）和 2個(gè) circRNAs（circ-ECT2L和circ-SPHKAP）分子可與BOLL共同競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oar-miR-760-3p（圖8）。

2.8 潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs在睪丸中的表達(dá)特征

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖9-A）顯示：隨著年齡的增加，oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表達(dá)量逐漸下降；LOC105616228和circ-ECT2L的表達(dá)量逐漸上調(diào)；LOC105602204、LOC105603195和circ-SPHKAP的表達(dá)量先上調(diào)而后呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)趨勢(shì)。由圖9-A可知，qRT-PCR與RNA-seq獲得的各非編碼RNAs在睪丸中的表達(dá)模式基本一致：相比3月齡，在1歲齡和3歲齡睪丸中各 miRNAs的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01），而lncRNAs和circRNAs的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

2.9 BOLL-miRNAs及miRNAs-circRNAs/lncRNAs靶向關(guān)系驗(yàn)證

由雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果（圖9-B）可知，相比對(duì)照組，oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p模擬物均顯著降低了293T細(xì)胞中的BOLL3′UTR野生型報(bào)告者的熒光素酶活性（P＜0.01），并且oar-miR-760-3p模擬物顯著降低了野生型Circ-ECT2L（P＜0.05）以及LOC105616228（P＜0.01）報(bào)告者的熒光素酶活性，但對(duì)相應(yīng)的突變型報(bào)告者均無(wú)明顯影響。oar-miR-382-5p模擬物對(duì)BOLL3′UTR野生型報(bào)告基因的熒光素酶活性無(wú)明顯影響（P＞0.05），oar-miR-760-3p模擬物對(duì)野生型 circ-SPHKAP、LOC105602204和LOC105603195報(bào)告基因的熒光素酶活性也無(wú)明顯影響（P＞0.05；結(jié)果未顯示）。這些結(jié)果表明，綿羊BOLL是oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p共有的直接作用靶標(biāo)，并且 circRNA Circ-ECT2L和 lncRNA LOC105616228作為ceRNAs, 可與BOLL共同競(jìng)爭(zhēng)性靶向結(jié)合oar-miR-760-3p。

圖6 發(fā)育的藏綿羊睪丸中BOLL mRNA和蛋白的表達(dá)規(guī)律Fig. 6 Expression patterns of BOLL mRNA and protein in developmental Tibetan sheep testes

圖7 藏綿羊睪丸中BOLL蛋白的免疫熒光染色Fig. 7 Immunofluorescence staining of BOLL protein in Tibetan sheep testis

圖8 綿羊BOLL的功能注釋及潛在的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 8 The functional annotation and potential ceRNA regulatory network for ovine BOLL

3 討論

首先通過(guò)克隆并測(cè)序獲得了藏綿羊BOLL的完整 CDS區(qū)，由 888 bp的核苷酸組成，可編碼 295個(gè)氨基酸，這與 NCBI中提供的綿羊預(yù)測(cè)序列（XM_004004798.4）完全一致，并且與在山羊[19]、川南山地黃牛[12]和牦牛[20]上報(bào)道的該基因 CDS區(qū)長(zhǎng)度一致。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，藏綿羊BOLL編碼區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與山羊、川南山地黃牛和牦牛的相似度均在99%以上，與其他哺乳動(dòng)物的序列相似度也高于95%（兔除外）。在進(jìn)化上，其與山羊、牦牛、川南山地黃牛也具有比較近的親緣關(guān)系。這些結(jié)果表明，藏綿羊BOLL同其他哺乳動(dòng)物具有高度的序列同源性和進(jìn)化保守性。

DAZ家族成員（包括BOLL）所編碼蛋白中均含有一個(gè) RRM 結(jié)構(gòu)域和至少一段 DAZ重復(fù)基序[6]。RRM結(jié)構(gòu)域作為真核生物細(xì)胞中最豐富的RNA結(jié)合元件，可通過(guò)與其他核酸或蛋白質(zhì)相互作用，以調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和衰變等環(huán)節(jié)而參與基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控（尤其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控），進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[21]。但對(duì)于DAZ重復(fù)基序，其在DAZ家族基因編碼蛋白中所承擔(dān)的具體功能目前仍不清楚。YEN等[22]依據(jù)自己的研究結(jié)果推測(cè)，DAZ重復(fù)基序可能參與RNA結(jié)合，也可能參與與其他蛋白質(zhì)的相互作用。EWIS等[23]研究發(fā)現(xiàn)，DAZ重復(fù)基序的缺失可造成男性生精能力下降。綜上所述，DAZ重復(fù)基序可能具有與 RRM結(jié)構(gòu)域相似的功能，即通過(guò)與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合從而貢獻(xiàn)于DAZ家族各成員自身的功能維持。與其他哺乳動(dòng)物一樣，本研究通過(guò)氨基酸序列分析表明，藏綿羊BOLL蛋白也具有一個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域（靠近N端）以及一段由25個(gè)氨基酸殘基組成的DAZ重復(fù)基序，并且二者對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在不同物種中高度相似。由此推測(cè)，藏綿羊BOLL蛋白所含的RRM結(jié)構(gòu)域和 DAZ重復(fù)基序在進(jìn)化和功能上是非常保守的，并且可能是其執(zhí)行并維持正常的生物學(xué)功能所必需的。

圖9 潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs的時(shí)間表達(dá)模式及靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig. 9 Temporal expression patterns of potential regulatory non-coding RNAs for BOLL gene and verification of the target relationship

鑒于BOLL蛋白可通過(guò)結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用，本研究進(jìn)一步借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在的與綿羊BOLL蛋白互作的基因編碼蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CDC25A、CDC20B 等 10個(gè)蛋白質(zhì)分子與 BOLL蛋白可能存在相互作用。其中，CDC25A和CDC20B作為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，被報(bào)道在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中廣泛參與生殖細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂等過(guò)程[24-25]。在成年雄性小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)，BOLL可與CDC25AmRNA靶向結(jié)合以調(diào)節(jié)其翻譯過(guò)程，從而對(duì)精母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)行調(diào)控[9]。LI等[11]在山羊上研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BOLL可通過(guò)上調(diào)減數(shù)分裂相關(guān)基因CDC25A的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)山羊生殖干細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程。與細(xì)胞周期蛋白所發(fā)揮的功能類(lèi)似，OAZ2和DDX4也被報(bào)道在雄性哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中表達(dá)并參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化[26-27]。在女性原始生殖細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BOLL可增加DDX4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程及單倍體卵子的形成[15]。同DAZ家族成員一樣，CPEB1也是一種RNA結(jié)合蛋白，已被報(bào)道在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，可靶向調(diào)控DAZ家族中另一成員DAZL的mRNA翻譯和蛋白積累，并且CPEB1和DAZL可通過(guò)調(diào)節(jié)共同靶標(biāo)mRNA的翻譯表達(dá)從而對(duì)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)行正向調(diào)控[28]。CPEB1的缺失不僅造成雌性小鼠不育，也可導(dǎo)致雄鼠精子發(fā)生停滯在減數(shù)分裂階段而嚴(yán)重?fù)p害其生育力[29]。類(lèi)似于CPEB1在睪丸中的調(diào)節(jié)功能，ING2可通過(guò)與相應(yīng)的靶標(biāo)結(jié)合參與精子發(fā)生過(guò)程，其缺失也可導(dǎo)致精子生成異常甚至雄性不育[30]。UBA5是泛素激活酶 E1的主要成員之一，而KPNA2和KPNA7均屬于核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。泛素化作為廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在精子發(fā)生過(guò)程中可將泛素分子結(jié)合到靶蛋白上，以參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能[31-32]。同樣，在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的特定階段，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)與不同的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)結(jié)合以轉(zhuǎn)運(yùn)其穿過(guò)核孔參與調(diào)控生殖細(xì)胞分化和精子發(fā)生[33]。RBM25作為RNA結(jié)合基序蛋白家族中的一員，被報(bào)道在小鼠睪丸精子細(xì)胞中特異表達(dá)[34]。綜上，這些潛在與綿羊BOLL互作的蛋白分子均在雄性動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)并扮演不同的角色，且大多已被報(bào)道具有結(jié)合并調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)分子的能力。這為深入理解BOLL在哺乳動(dòng)物，尤其綿羊睪丸發(fā)育期間的分子作用機(jī)理提供了新的見(jiàn)解和思路，但這些蛋白是否與BOLL存在相互作用并且通過(guò)何種機(jī)制貢獻(xiàn)于生精細(xì)胞的表型維持及精子生成，仍有待進(jìn)一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，在性成熟后藏綿羊睪丸中BOLL在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均顯著上調(diào)，這與以前研究報(bào)道其在具有正常生精能力（性成熟后）的哺乳動(dòng)物睪丸中高表達(dá)[35-36]的結(jié)果相符，表明BOLL可能主要在性成熟后藏綿羊睪丸中發(fā)揮作用。盡管BOLL是一個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因，但在睪丸中的表達(dá)不僅僅局限于減數(shù)分裂階段的精母細(xì)胞中。如在成年小鼠睪丸中，BOLL蛋白不僅存在于精母細(xì)胞中，也在圓形和長(zhǎng)形精細(xì)胞、精子及部分精原細(xì)胞中分布[37]。在地鼠睪丸中，BOLL蛋白除了在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精細(xì)胞中表達(dá)外，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中也有分布[10]。為了明確BOLL蛋白在發(fā)育的藏綿羊睪丸細(xì)胞中所呈現(xiàn)的表達(dá)特征及發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，BOLL蛋白在性成熟前睪丸中存在于部分精原細(xì)胞中，而在性成熟后主要分布于精細(xì)胞中，在精母細(xì)胞和精原細(xì)胞中也有較弱的陽(yáng)性信號(hào)且隨著年齡的增加信號(hào)強(qiáng)度更加弱化。這與在小鼠睪丸中[9]，研究發(fā)現(xiàn)該基因在圓形精細(xì)胞中高表達(dá)并發(fā)揮作用的結(jié)果類(lèi)似，提示BOLL可能主要在藏綿羊精子發(fā)生中參與調(diào)控減數(shù)分裂后的單倍體精子細(xì)胞進(jìn)一步向成熟精子發(fā)育。這也與在小尾寒羊（低海拔、性成熟早、繁殖力高）[36]和地鼠[10]上報(bào)道BOLL蛋白在睪丸生殖細(xì)胞中的分布特征基本一致，但與在小尾寒羊上研究結(jié)果不同的是，BOLL蛋白在性成熟后小尾寒羊睪丸中主要表達(dá)于精母細(xì)胞和圓形精細(xì)胞中。此外，有趣的是，在藏綿羊睪丸中，隨著年齡的增加，BOLL在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)逐漸上調(diào)，而在翻譯水平的表達(dá)先（性成熟）上調(diào)而后（成年）出現(xiàn)下調(diào)，這與在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都發(fā)現(xiàn)BOLL在成年小尾寒羊睪丸中表達(dá)上調(diào)（相比性成熟階段）[36]的結(jié)果不一致。這些差異可能是由于基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表觀遺傳機(jī)制因品種的繁殖力和生存環(huán)境不同而異所造成的。已有研究報(bào)道，在具有不同繁殖力的綿羊品種卵巢中許多基因的表達(dá)及調(diào)控作用存在差異[38]。正如在雄性不育的人[18]和犏牛[20]睪丸中發(fā)現(xiàn)的BOLL表達(dá)很微弱甚至不表達(dá)，在發(fā)育的綿羊睪丸中，相比同處于成年期（精子產(chǎn)生旺盛期）的具有高繁殖力的小尾寒羊[36]，藏綿羊睪丸內(nèi)BOLL蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，這可能與其繁殖力較低有關(guān)，但其具體作用機(jī)制的差異性還需進(jìn)一步研究與證實(shí)。這為從細(xì)胞和分子水平探究不同繁殖力的種公羊品種在睪丸發(fā)育分子遺傳機(jī)理方面的差異提供了思路。

在藏綿羊睪丸中BOLL mRNA和蛋白的表達(dá)趨勢(shì)及表達(dá)改變倍數(shù)存在差異，這可能是由于基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等水平的嚴(yán)格調(diào)控所造成的。非編碼 RNAs（lncRNAs、miRNAs、circRNAs等）作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等層面參與調(diào)控基因的表達(dá)[39]。同樣，哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程也受到許多非編碼RNAs的調(diào)控[40-41]。有研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)原始生殖細(xì)胞中miR-430可靶向抑制DAZL（與BOLL屬同一家族）的mRNA表達(dá)[42]，但有關(guān)靶向調(diào)控BOLL的miRNAs研究仍處于空白階段。本研究基于前期有關(guān)藏綿羊睪丸組織的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)并借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs，即ceRNAs作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了鑒定與分析，并通過(guò)qRT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)其表達(dá)特征和靶向關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)，oar-miR-127-5p和 oar-miR-760-3p可直接靶向調(diào)控藏綿羊BOLL的表達(dá)并且 circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 oar-miR-760-3p而調(diào)控BOLL的表達(dá)。為了進(jìn)一步理解ceRNA介導(dǎo)調(diào)控綿羊BOLL所涉及的生物學(xué)功能，對(duì)BOLL參與的生物學(xué)過(guò)程和功能進(jìn)行了詳細(xì)注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)其主要參與配子生成、細(xì)胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄后及翻譯起始調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。以上結(jié)果表明，在藏綿羊睪丸中，BOLL的表達(dá)受miRNAs及ceRNAs調(diào)控，進(jìn)而可能與可激活下游信號(hào)或事件的蛋白分子相互作用，以響應(yīng)生精細(xì)胞的發(fā)育及精子生成。該研究填補(bǔ)了在綿羊睪丸中有關(guān)BOLL表達(dá)與調(diào)控作用認(rèn)識(shí)的空白，豐富了對(duì)其在綿羊甚至其他哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中潛在的分子作用機(jī)制的理解，并為進(jìn)一步的功能探究提供了新的理論視角。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得藏綿羊BOLL完整CDS區(qū)序列，其在哺乳動(dòng)物間具有高度進(jìn)化保守性，并發(fā)現(xiàn)該基因主要表達(dá)于性成熟后藏綿羊睪丸精子細(xì)胞中，且在精母細(xì)胞和整個(gè)發(fā)育階段的精原細(xì)胞中也有表達(dá)。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p直接靶向抑制綿羊BOLL的表達(dá)；circRNA Circ-ECT2L和 lncRNA LOC105616228作為ceRNAs，可與BOLL共同競(jìng)爭(zhēng)性吸附oar-miR-760-3p而正向調(diào)控綿羊BOLL的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)與下游分子相互作用以激活細(xì)胞增殖或分化相關(guān)信號(hào)事件來(lái)調(diào)控精子發(fā)生，尤其減數(shù)分裂后的單倍體精子細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育。