宣雄智， 李文嘉，朱文婷， 蘇杰南

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；3.廣州市科沐生物科技有限公司，廣東廣州 510663）

隨著人們生活水平的日益提高，對高質(zhì)量魚類蛋白的需求也越來越大，然而，當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展高度依賴以魚粉和魚油為代表的飼料原料（艾祖軍等，2019）。因此，一方面，尋找可替代魚粉的飼料蛋白源，另一方面，研發(fā)富含生物活性物質(zhì)的綠色高效配合飼料以促進(jìn)水產(chǎn)動物健康生長，提高水產(chǎn)品品質(zhì)已成為現(xiàn)階段水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要目標(biāo)。

我國藻類資源豐富，尤其是海藻在飼料、食品和制藥行業(yè)的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，其不僅可為水產(chǎn)動物提供蛋白質(zhì)、脂肪與碳水化合物三大營養(yǎng)素，同時(shí)也是色素、水溶性和脂溶性維生素以及礦物質(zhì)等生物活性化合物的天然來源 （吳曉娟等，2015）。研究表明，將不同種類、不同劑量的海藻粉添加到配合飼料中，可促進(jìn)水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、提高飼料利用率、抗應(yīng)激性和免疫性能，還能一定程度改善魚肉品質(zhì)（陳明等，2016；李雅婷等，2016）。常見大型海藻主要有褐藻、紅藻和綠藻三種類型，其中紅藻的粗蛋白質(zhì)含量高，活性物質(zhì)種類豐富，比褐藻和綠藻更適合作為水產(chǎn)動物的飼料原料 （Fleurence等，2004）。龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是一種大型紅藻，其粗蛋白質(zhì)含量約占干物質(zhì)的20%，還富含膳食纖維、微量元素等多種營養(yǎng)成分（陳曉鳳，2012），廣泛養(yǎng)殖于我國沿海地區(qū)，目前主要作為提取瓊膠和卡拉膠的原料，還可以作為經(jīng)濟(jì)貝類鮑魚的天然餌料及加工成即食海洋蔬菜。龍須菜作為飼料原料部分替代籃子魚 （徐樹德等，2014）、黑鯛（Xuan 等，2013）、真鯛（Xuan 等，2019）、異育銀鯽（宣雄智等，2018）和草魚（陳明等，2016）等水產(chǎn)動物飼料中的魚粉或豆粕已被證明是可行的。然而龍須菜所含的碳水化合物多以纖維素、瓊膠等非淀粉多糖形式存在，其不僅難以被魚類有效利用，還可能對魚類生長代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。有研究表明，纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶對藻類多糖有一定的體外酶解效果（李茜等，2013）。黃斑籃子魚攝食含非淀粉多糖酶的石莼飼料后，生長性能和飼料利用率都有所提高（游翠紅等，2014）。

翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）屬鯉形目，鯉科，鲌屬，俗稱太湖白魚，是太湖著名河鮮“太湖三白”之一，分布于我國大部分水系。翹嘴紅鲌生長快、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，頗受人們青睞。由于野生資源的減少，市場需求的不斷增加，近年來翹嘴紅鲌已成為長江中下游地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的名貴品種。

迄今為止，海藻在飼料中的應(yīng)用多以海水雜食性或植食性魚類為研究對象（宣雄智等，2018；陳明等，2016；游翠紅等，2014；李茜等，2013），鮮有關(guān)于紅藻替代飼料中的魚粉對淡水肉食性魚類的影響研究。因此，本試驗(yàn)通過在飼料中添加不同水平的龍須菜，研究其對翹嘴紅鲌生長、體組成和代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響，以判斷龍須菜作為翹嘴紅鲌飼料原料的可行性，同時(shí)，本試驗(yàn)探索了非淀粉多糖酶對攝食龍須菜飼料的翹嘴紅鲌的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 本試驗(yàn)所用龍須菜購自福建寧德某公司。龍須菜經(jīng)清洗后，置于戶外陰干（約2周）。所有飼料原料粉碎后過60目篩，充分混勻后采用逐級擴(kuò)大的方法添加維生素和礦物質(zhì)等微量組分，然后加水混勻（飼料干物質(zhì)和水分質(zhì)量比約為7：3），隨后用硬顆粒擠壓機(jī)制成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，室溫風(fēng)干后密封于真空包裝袋中，存放于－20℃冰箱中待用。以不含龍須菜藻粉的飼料為對照組，配制4組試驗(yàn)飼料，分別以2.5%、5%、7.5%、10%龍須菜等氮替代基礎(chǔ)飼料中的魚粉，編號為D1～D4，此外，以D4組飼料配方為基礎(chǔ)，在其中添加0.2%非淀粉多糖復(fù)合酶，編號為D5。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)）%

1.2 試驗(yàn)魚和飼養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)用翹嘴紅鲌購自湖州某種苗場，試驗(yàn)開始前，先將試驗(yàn)魚在室內(nèi)水族箱 （規(guī)格70 cm×85 cm，300 L圓柱型）馴化2周，馴化期間投喂對照組飼料。養(yǎng)殖試驗(yàn)共6組，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)開始前，試驗(yàn)魚禁食24 h，隨機(jī)選擇健康且規(guī)格基本一致的幼魚用丁香酚（40 mg/L）麻醉，稱體質(zhì)量后放入水族箱中，每箱30 尾。 試驗(yàn)魚初始體質(zhì)量為（13.2±0.2）g，試驗(yàn)期間每日換水兩次，換水量為總水量的1/3，水溫為（25±2）℃，pH 為 7.5 左右；采用連續(xù)充氣，水體溶氧≥5 mg/L；每天清晨用虹吸法吸除養(yǎng)殖缸底部的殘餌與糞便。每天飽食投喂 2 次（8：30，16：30），具體以試驗(yàn)魚不再搶食為準(zhǔn)，記錄投飼量，試驗(yàn)持續(xù)8周。養(yǎng)殖試驗(yàn)最后兩周，給翹嘴紅鲌投喂含1%Cr2O3的消化率試驗(yàn)飼料，飼喂 2 h后用虹吸法收集糞便，每次30 min。收集到的糞便用紗布過濾，60℃烘干，用于飼料表觀消化率的測定。

1.3 樣品收集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，魚體禁食24 h，用40 mg/L丁香酚麻醉后逐尾稱重。每缸隨機(jī)挑取12尾，其中5尾麻醉致死，放入－20℃冰箱中用于全魚成分分析。其余的魚用不加抗凝劑的注射器從尾靜脈采血，低溫離心（1500 r/min，15 min，4℃）分離取上層淡黃色液體即為血清。離心后的血清經(jīng)液氮速凍后置于超低溫冰箱（－80℃）保存?zhèn)溆?。將上述抽完血的試?yàn)魚（每處理組共15尾）用于肝臟、前腸取樣，所取樣品裝袋后經(jīng)液氮速凍保存于超低溫冰箱（－80℃）待用。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 常規(guī)生長及血清生化成分測定 飼料和全魚樣品的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量，肝臟的水分和粗脂肪含量均按國標(biāo)方法測定。全魚和飼料蛋白成分通過凱氏定氮儀測定，粗脂肪用索氏抽提法測定；使用馬弗爐在550℃下烘6 h測定灰分；使用烘箱105℃過夜測定樣品中的水分；血清總蛋白、總膽固醇、甘油三酯、溶菌酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定依照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行。

試驗(yàn)魚的增重率、飼料轉(zhuǎn)化率、攝食率等指標(biāo)計(jì)算公式如下：

增重率=（Wt-W0）/W0；

飼料轉(zhuǎn)化率=（Wt-W0＋Wd）/I；

攝食率/%=100×I/[t×（W0（g）＋ Wt（g））/2]；

成活率=末尾數(shù)/初尾數(shù)×100%；

蛋白質(zhì)效率=（Wt-W0）/（I×Cp）×100%；

式中：Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量，g；W0為試驗(yàn)初始體質(zhì)量，g；t為試驗(yàn)時(shí)間，d；Wd為死亡魚體質(zhì)量，g；Cp為飼料中粗蛋白質(zhì)含量；I為飼料干物質(zhì)總投喂量，g。

肝體比、臟體比的計(jì)算公式為：

肝體比/%=肝臟鮮質(zhì)量/魚體鮮質(zhì)量×100；

臟體比/%=內(nèi)臟團(tuán)鮮質(zhì)量/魚體鮮質(zhì)量×100。

1.4.2 消化相關(guān)酶活性測定 酶液的制備及蛋白酶活性的測定參照宋林等（2013）所報(bào)道的方法，脂肪酶、淀粉酶和堿性磷酸酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，粗酶液中蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán) （南京建成生物工程研究所）染色法，具體測定方法參考試劑盒說明書。

1.4.3 表觀消化率測定 表觀消化率的測定參照Cho（1990）所報(bào)道的方法，本研究以 1%Cr2O3作為指示劑，對所配制的試驗(yàn)飼料組干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的表觀消化率進(jìn)行了測定。具體計(jì)算如下：

表觀消化率＝[1－（A0/A×B/B0）]×100%；

式中：A、A0分別為飼料中和糞便中的營養(yǎng)物質(zhì)含量；B、B0分別為飼料和糞便中的Cr2O3含量。

2 結(jié)果

2.1 龍須菜對翹嘴紅鲌生長、體組成和飼料利用率的影響 養(yǎng)殖試驗(yàn)期間所有試驗(yàn)組翹嘴紅鲌攝食率無顯著差異，各組生長性能和飼料利用情況、表觀消化率和全魚及肝臟成分見表2～4。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中，隨著飼料中龍須菜替代比例的提高，翹嘴紅鲌?jiān)鲋芈食氏瘸制胶笙陆档内厔荻误w比和臟體比則均呈下降趨勢。與對照組相比，D3組和D4組增重率分別下降13.07%和14.07%（P＜0.05），臟體比分別下降 11.19%和 11.72（P＜0.05）。D4組全魚粗脂肪含量比對照組下降10.4%（P＜0.05），此外，該組干物質(zhì)和粗脂肪表觀消化率分別下降4.01%和3.79%（P＜0.05）。

2.2 龍須菜對翹嘴紅鲌消化相關(guān)酶活性和血液生化指標(biāo)的影響 翹嘴紅鲌消化相關(guān)酶活性和血液生化指標(biāo)見表5～6。與對照組相比，D3組和D4組翹嘴紅鲌前腸脂肪酶活性分別下降19.18%和19.88%（P＜0.05），D4組前腸堿性磷酸酶活性也下降29.03%（P＜0.05）；血液指標(biāo)方面，D1組翹嘴紅鲌血液總蛋白含量上升15.18%（P＜0.05），D3組和D4組血清膽固醇含量分別下降24.11%和33.69%（P ＜ 0.05），D2組、D3組和 D4組血清甘油三酯分別下降20.79%、19.37%和27.06%（P＜0.05）。隨著龍須菜替代比例的提高，各試驗(yàn)組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均呈上升趨勢，但與對照組無顯著差異。

表2 養(yǎng)殖8周后翹嘴紅鲌的生長和飼料利用情況

表3 養(yǎng)殖8周后翹嘴紅鲌對龍須菜飼料的表觀消化率%

表4 養(yǎng)殖8周后翹嘴紅鲌全魚及肝臟成分%

2.3 龍須菜飼料中添加非淀粉多糖酶對翹嘴紅鲌的影響 在10%龍須菜飼料中添加0.2%非淀粉多糖酶后，D5組翹嘴紅鲌攝食率和成活率比D4組分別提高9.85%和7.31%（P＜0.05），與對照組均無顯著差異（表2）。D5組飼料干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率均高于D4組，且干物質(zhì)表觀消化率比D4組提高了4.19%（P＜0.05）（表3）。D5組前腸蛋白酶、脂肪酶和堿性磷酸酶活性分別比D4組提高 5.75%（P＞0.05）、7.08%（P ＞ 0.05）和 29.54%（P ＜ 0.05）（表 5）。

3 討論

3.1 龍須菜對翹嘴紅鲌生長、體組成和飼料利用率的影響分析 龍須菜富含八種必需氨基酸、牛磺酸及多種必需微量元素，其藻膽蛋白具有抗氧化、抑制腫瘤等生理活性（余杰等，2006）。有研究表明用1%～5%的龍須菜飼料喂養(yǎng)眼斑擬石首魚促進(jìn)了該魚的腸道健康，一定程度上提高了其增重率（李雅婷等，2016），本試驗(yàn)中，龍須菜藻粉替代比例不超過5%時(shí)，對翹嘴紅鲌的生長性能無顯著影響，與宣雄智等（2018）的研究結(jié)果相一致，但當(dāng)龍須菜替代比例達(dá)到或超過7.5%時(shí)，翹嘴紅鲌?jiān)鲋芈曙@著下降。有研究指出，用龍須菜飼料飼喂黑鯛 （Xuan等，2013）、真鯛 （Xuan等，2019）和異育銀鯽（宣雄智等，2018）時(shí)，其最大替代比例均可達(dá)15%，而對養(yǎng)殖魚類的生長和攝食無負(fù)面影響。產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于鯛科魚類為海洋雜食偏肉食性魚類，海藻是其天然餌料的組成部分，其對海藻有較好的消化能力（Nakagawa，1997），異育銀鯽是淡水雜食偏植食性魚類，其對植物蛋白源的接受度也較高 （王永玲等，2011），而翹嘴紅鲌屬于淡水肉食性魚類，營養(yǎng)需求高，對植物蛋白源營養(yǎng)成分的消化率較低（蔣蓉等，2005），本試驗(yàn)中龍須菜替代比例達(dá)10%時(shí)，飼料干物質(zhì)表觀消化率的下降也說明了這一點(diǎn)。

表5 養(yǎng)殖8周后翹嘴紅鲌肝臟和前腸消化酶活性U/mg protein

表6 養(yǎng)殖8周后翹嘴紅鲌的血清指標(biāo)

研究表明，在飼料中添加大型海藻或者微藻會對水產(chǎn)動物的體脂代謝產(chǎn)生影響，這種影響因藻類和養(yǎng)殖魚類的種類差異而不同 （Xuan等，2019；宣雄智等，2018；Xuan 等，2013）。 本試驗(yàn)中D4組翹嘴紅鲌全魚脂肪含量顯著下降，這可能是由以下原因所致，一方面，雖然本試驗(yàn)所用各組飼料是等氮等脂的，但飼料碳水化合物的種類不同，龍須菜粗多糖含有較多的膠體，不能被養(yǎng)殖魚類有效利用（朱地琴等，2012），因此，隨著龍須菜替代比例的提高，試驗(yàn)組飼料的可消化能逐漸降低，另一方面龍須菜富含的瓊膠多糖有較高的黏性，能在一定程度上吸附油脂（宣雄智，2014），從而抑制了翹嘴紅鲌對飼料脂肪的吸收，降低了粗脂肪表觀消化率。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組全魚粗蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)效率和粗蛋白質(zhì)表觀消化率未受顯著影響，這表明龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸比例平衡（Xuan 等，2019；徐樹德等，2014），能被翹嘴紅鲌較好地利用。

當(dāng)龍須菜替代比例大于7.5%時(shí)，翹嘴紅鲌臟體比顯著降低，而肝體比卻未受顯著影響，這與龍須菜飼料飼喂黑鯛的試驗(yàn)結(jié)果不同 （宣雄智，2014），表明龍須菜飼料能影響翹嘴紅鲌的脂肪代謝且腹腔脂肪含量比肝臟脂肪含量更易受影響。3.2 龍須菜對翹嘴紅鲌消化相關(guān)酶活性和血液生化指標(biāo)的影響分析 魚類消化酶主要可分為蛋白酶、酯酶、碳水化合物分解酶三大類（張偉等，2007）。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組翹嘴紅鲌前腸蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性遠(yuǎn)高于肝胰臟相關(guān)酶的活性，可能是由于翹嘴紅鲌為鯉科無胃魚類，其肝胰臟分泌的酶原沒有活性，進(jìn)入腸道后才被激活（Das等，1991）。翹嘴紅鲌腸道消化酶活性的大小將影響其對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，當(dāng)龍須菜替代比例超7.5%時(shí)，翹嘴紅鲌前腸脂肪酶活性顯著下降，這一結(jié)果也與粗脂肪表觀消化率和全魚脂肪含量的下降相呼應(yīng)。

堿性磷酸酶是存在于魚類前腸上皮細(xì)胞淺部和紋狀緣上的一種協(xié)助腸上皮細(xì)胞吸收的金屬酶，與脂類、葡萄糖、鈣和無機(jī)磷的吸收狀況呈正相關(guān)，可表征腸細(xì)胞的分化程度和腸道消化功能的完善程度（張偉，2008）。本試驗(yàn)中，龍須菜替代比例達(dá)10%時(shí)，翹嘴紅鲌堿性磷酸酶活性顯著下降，推測龍須菜所含的多糖類膳食纖維可能抑制了翹嘴紅鲌末端腸上皮細(xì)胞的消化代謝。

血清蛋白質(zhì)主要維持膠體滲透壓，還具有運(yùn)輸載體、免疫和代謝調(diào)控等作用。本試驗(yàn)中，龍須菜替代比例為2.5%時(shí)，翹嘴紅鲌血清總蛋白含量顯著上升，與宣雄智等（2018）用龍須菜飼喂異育銀鯽的結(jié)果一致，這可能與龍須菜含有藻膽蛋白、多糖等具有益生素功能的物質(zhì)有關(guān) （陳美珍，2005），而血清蛋白質(zhì)含量升高有利于提高翹嘴紅鲌的代謝水平和免疫能力（趙紅霞等，2008）。

一般認(rèn)為，肝臟有炎癥或肝細(xì)胞發(fā)生病變、壞死時(shí)，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高（宣雄智等，2018）。本試驗(yàn)中，隨著龍須菜替代比例的提高，翹嘴紅鲌血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性雖呈上升趨勢，但與對照組差異不顯著，且肝胰臟各消化酶活性也未發(fā)生明顯變化，因此翹嘴紅鲌肝功能可能未受龍須菜飼料的影響。

魚類血清中脂類主要包括：磷脂、膽固醇、甘油三酯、非酯化脂肪酸四大類。血脂水平可以間接反映全身脂質(zhì)代謝狀況（Nakagawa，1997）。本試驗(yàn)中，當(dāng)龍須菜替代比例達(dá)到或超過5%時(shí)，翹嘴紅鲌血清甘油三酯含量顯著低于對照組，部分研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼料中龍須菜替代達(dá)一定比例時(shí)，養(yǎng)殖魚類血清甘油三酯含量會顯著下降 （陳明等，2016；游翠紅等，2014），這可能是由于龍須菜瓊膠多糖在腸道中吸水膨脹，食糜黏性增加，胃排空減慢，間接導(dǎo)致飼料脂肪吸收減少 （倪德江等，2004）。血液總膽固醇含量可間接反映魚體脂類吸收及肝臟脂肪代謝狀況（Nakagawa，1997）。本試驗(yàn)中，當(dāng)龍須菜替代比例達(dá)到或超過7.5%時(shí)，翹嘴紅鲌血清膽固醇含量顯著下降，不少研究表明魚類攝食含植物蛋白源飼料后血液膽固醇含量下降（陳明等，2016；游翠紅等，2014），可能是由于胃腸道對膽固醇的吸收受到抑制，也可能由于龍須菜多糖調(diào)節(jié)脂代謝基因表達(dá)，加快膽汁酸的排泄，從而降低體內(nèi)膽固醇含量（黃詩銘，2019）。

3.3 龍須菜飼料中添加非淀粉多糖酶對翹嘴紅鲌的影響分析 一般認(rèn)為，水產(chǎn)動物不能分泌纖維素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶等非淀粉多糖酶，大型海藻所含的碳水化合物主要是海藻膠、粗纖維類等非淀粉多糖，難以被水產(chǎn)動物消化（游翠紅等，2014），特別是細(xì)胞壁中的纖維素和果膠不僅難以消化，還會影響腸道消化酶對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的分解，降低飼料利用效率 （宣雄智，2014）。非淀粉多糖酶則具有消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料利用率，促進(jìn)動物生長的作用（游翠紅等，2014）。體外研究表明，龍須菜可被纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶酶解（李茜等，2013），游翠紅等（2014）在石莼飼料中添加非淀粉多糖酶，有效提高了黃斑籃子魚的生長效果和飼料利用率。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與攝食10%龍須菜飼料的試驗(yàn)組相比，添加非淀粉多糖酶可以顯著提高翹嘴紅鲌的干物質(zhì)表觀消化率、前腸堿性磷酸酶活性、增重率和存活率，這可能是由于非淀粉多糖酶的添加改善了腸道的生理狀況，促進(jìn)了翹嘴紅鲌腸道對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，減輕了龍須菜多糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子帶來的負(fù)面影響。本試驗(yàn)中，翹嘴紅鲌的攝食率未受龍須菜飼料的影響，但在10%龍須菜飼料中添加非淀粉多糖酶后，翹嘴紅鲌攝食率顯著升高，這可能是由于龍須菜含有呈味氨基酸等誘食性物質(zhì)（宣雄智，2014），另一方面在非淀粉多糖酶作用下，龍須菜所含膳食纖維被腸道菌群發(fā)酵，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，刺激了腸道黏膜，加速了腸道排空。

4 結(jié)論

用2.5%的龍須菜替代飼料中的魚粉有助于提高翹嘴紅鲌的非特異性免疫，當(dāng)龍須菜替代比例達(dá)7.5%時(shí)，翹嘴紅鲌生長性能顯著下降；進(jìn)一步提高龍須菜替代比例至10%時(shí)，翹嘴紅鲌對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力和生長性能均會受抑制。飼料中添加龍須菜能顯著影響翹嘴紅鲌的脂肪代謝，降低全魚脂肪含量。非淀粉多糖酶的添加可以一定程度改善龍須菜飼料對翹嘴紅鲌產(chǎn)生的負(fù)面影響，提高龍須菜在飼料中的添加比例，但具體的添加量仍需進(jìn)一步研究。