張強，金恒，吳麗娟，謝喬，劉瑞平，王利華，蘇州，鐘云平，邱光忠

（1.贛州市畜牧研究所，江西贛州341401；2.贛州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

贛南作為全國最大的臍橙主產(chǎn)區(qū)，被譽為“世界橙鄉(xiāng)”，2019年臍橙種植面積達10.8 萬hm2，總產(chǎn)量122 萬t，產(chǎn)值129 億元。贛南臍橙深加工后副產(chǎn)物臍橙渣的營養(yǎng)較為豐富，其碳水化合物和鈣含量較高，氨基酸組分較全面，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷含量偏低[1]。通過一定工藝提高臍橙渣的蛋白含量，可提升臍橙渣的營養(yǎng)價值。宋睿等[2]利用響應(yīng)面法研究冰糖橙皮固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白技術(shù)，冰糖橙皮真蛋白含量由19.93%提高到23.85% 。陳卓男[1]、Crosswhite[3]和Noh[4]在育肥豬日糧中分別添加贛南臍橙皮、青貯柑橘渣、發(fā)酵柑橘渣等成分，發(fā)現(xiàn)均能顯著提高肥育豬的飼料轉(zhuǎn)化率。另外，飼料微生物具有維護畜禽腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力的功能[5～6]。因此，將臍橙渣開發(fā)成益生菌發(fā)酵飼料，即可增加植物蛋白飼料來源，又能增強動物免疫力，促進畜牧行業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。目前，關(guān)于臍橙渣制作生物發(fā)酵飼料的文獻報道較少。本試驗研究了麩皮添加比例、菌種、尿素和磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料的蛋白含量的影響，旨在提高臍橙渣發(fā)酵飼料的真蛋白含量。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

臍橙渣：含水量約12%，購置于青島科奈爾農(nóng)產(chǎn)品有限公司；麩皮、尿素：市售；碳酸鈣：天津市北辰方正試劑廠，分析純；磷酸二氫鉀：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，分析純。

安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌：河南君安生物科技有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母：無錫拜弗德生物科技有限公司；黑曲霉：濟寧玉園生物科技有限公司；纖維素酶：濟南天天香有限公司。以上菌種和酶均為細(xì)顆?；蚍勰┬螒B(tài)。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉：西隴化工股份有限公司，分析純；硫酸鉀：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純。

儀器：LAC-5080S 高壓滅菌鍋：上海博訊儀器儀表有限公司；粉碎機：河北金琦機械廠；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；FA2004 電子天平：上海上平儀器有限公司；250 mL 凱氏燒瓶：蜀牛；半微量定氮蒸餾器：上海昕滬實驗設(shè)備有限公司；DK-98-Ⅱ電爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方案

1.3.1 麩皮添加比例試驗。本試驗的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：2%尿素，1%碳酸鈣，36.79%水，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及麩皮和臍橙渣。各試驗組配方中麩皮和臍橙渣的含量，見表1。

表1 麩皮添加比例試驗配方中麩皮和臍橙渣的百分含量 %

1.3.2 不同菌種試驗。本試驗的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，以及菌種和水。各試驗組配方中菌種和水的含量，見表2。

表2 不同菌種試驗配方中菌種的添加種類與百分含量 %

1.3.3 尿素濃度試驗。本試驗的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，1%碳酸鈣，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及尿素和水。各試驗組配方中尿素和水的含量，見表3。

表3 尿素濃度試驗配方中尿素的添加濃度 %

1.3.4 磷酸二氫鉀濃度試驗。本試驗的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方包含：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，以及磷酸二氫鉀和水。各試驗組配方中磷酸二氫鉀和水的含量，見表4。

表4 磷酸二氫鉀濃度試驗配方中磷酸二氫鉀的添加濃度 %

1.4 操作方法

配制含菌劑的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，30±1 ℃下發(fā)酵3 d，將發(fā)酵產(chǎn)物烘干（溫度102℃），粉碎，進行真蛋白含量測定，每個處理3 次平行試驗。

1.5 真蛋白含量測定

將樣品加入蒸餾水中煮沸，依次加入過量的硫酸銅水溶液、氫氧化鈉溶液。在一定堿性條件下，蛋白質(zhì)被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的測定方法測定其含氮量[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法分析，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩皮添加比例試驗

本試驗研究麩皮添加比例對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響。

圖1 麩皮添加比例對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，2 組和3 組的真蛋白含量提高較顯著（P＜0.05），相對于自身未發(fā)酵的樣品，真蛋白分別提高了7.69%、11.37%。為更好的了解臍橙渣的發(fā)酵特性，本試驗選取輔料配比更低的組合進行研究，故優(yōu)化后的麩皮添加比例是6%（臍橙渣添加比例是54%）。

2.2 不同菌種試驗

本試驗將安琪酵母與不同菌種配合來發(fā)酵臍橙渣飼料，考察不同菌種組合對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響。

圖2 不同菌種對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，6 個試驗組的真蛋白含量，與對照組相比有顯著提升（P＜0.05）。1 組、2 組、3 組、4 組之間的真蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）；1 組、2 組、3組、4 組的真蛋白含量，比5 組、6 組的更高，且差異顯著（P＜0.05）。以上說明，1 組、2 組、3 組、4 組是較優(yōu)的菌種或菌種組合。由于乳酸菌具有較多的優(yōu)良特性，如潘小梅等[8]利用乳酸菌產(chǎn)生果膠酶等水解酶，降低柑橘皮渣中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量。且乳酸菌應(yīng)用廣泛，具有保護動物（人體）腸道、提高機體免疫力等功效，所以采用安琪酵母與乳酸菌雙菌組合的方案對臍橙渣飼料進行微生物發(fā)酵。

2.3 尿素濃度試驗

本試驗以尿素為無機氮源，配置成0%、1%、2%和3%等4 種尿素添加比例的臍橙渣發(fā)酵培養(yǎng)基，研究不同濃度的尿素對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響。

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，3 個試驗組的真蛋白含量與對照組相比，均有顯著提升（P＜0.05）。其中，2組（添加2%尿素）的真蛋白含量約為7.06%，比對照組提高了9.29%；3 組（添加3%尿素）的真蛋白含量約為6.97%，比對照組提高了7.89%。說明添加2%尿素是該固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中尿素的較優(yōu)添加濃度。

圖3 尿素濃度對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

2.4 磷酸二氫鉀濃度試驗

本試驗研究不同濃度的磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響。

圖4 磷酸二氫鉀濃度對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，發(fā)酵3 d 后，3 個試驗組的真蛋白含量與對照組相比，均無顯著差異（P＞0.05），可能原因是輔料麩皮中磷源含量豐富。1 組的真蛋白含量是7.21%，與對照組（7.03%）相比提高了2.56%；3組的真蛋白含量是6.91%，略低于對照組。以上試驗結(jié)果說明，在配方中添加0.1%磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白的合成起到一定的促進作用。

進一步檢測發(fā)現(xiàn)，1 組的真蛋白含量（7.21%）與其本身未發(fā)酵的樣品（6.34%）對比提高了13.72%。經(jīng)過對臍橙渣發(fā)酵飼料的固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，臍橙渣飼料的真蛋白含量獲得較大的提升。

3 討論

3.1 麩皮添加比例試驗

6%麩皮是臍橙渣發(fā)酵飼料較優(yōu)的輔料添加比例。如果麩皮添加比例過高，那么微生物將更多的利用有機氮源麩皮，由無機氮源尿素合成蛋白質(zhì)的量則減少，產(chǎn)物中真蛋白含量提高不顯著。曾柏全等[9]進行了類似的研究，采用15%麩皮作為固態(tài)發(fā)酵冰糖臍橙皮渣培養(yǎng)基最優(yōu)輔料濃度。

3.2 不同菌種試驗

確定采用安琪酵母與乳酸菌雙菌組合方案發(fā)酵臍橙渣飼料。酵母菌是高產(chǎn)蛋白菌種，本試驗中乳酸菌與安琪酵母組合發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量較高，說明可用乳酸菌和安琪酵母組合發(fā)酵臍橙渣飼料。在柑橘皮渣文獻中也有菌種組合發(fā)酵的研究，如：程錦等[10]研究確定采用米曲霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母三菌組合方案且比例為1:2:2 時，柑橘皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白最高。

3.3 尿素濃度試驗

添加2%尿素可使臍橙渣發(fā)酵飼料的真蛋白含量獲得大幅提升。一般微生物適宜的碳氮比是25:1，本文添加2%尿素培養(yǎng)基的碳氮比接近25:1，較適合微生物生長。

3.4 磷酸二氫鉀濃度試驗

0.1%磷酸二氫鉀是臍橙渣發(fā)酵飼料優(yōu)化的磷源添加比例。臍橙渣中磷源含量（0.22%）較低，添加適宜的磷酸二氫鉀能促進臍橙渣飼料菌體蛋白合成。類似文獻[11]報道，10 g 發(fā)酵底物（不包括水含量）中添加0.04 g 磷酸二氫鉀，蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，且添加量在0.04～0.06 g 范圍時，蛋白質(zhì)產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

通過研究麩皮添加比例、菌種、尿素和磷酸二氫鉀對臍橙渣發(fā)酵飼料的蛋白含量的影響，臍橙渣發(fā)酵飼料真蛋白含量達到7.21%，與發(fā)酵前樣品對比提高了13.72%。本次試驗確定臍橙渣發(fā)酵飼料優(yōu)化后配方的主要成分為：54%臍橙渣，6%麩皮，2%尿素，1%碳酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纖維素酶，36.69%水。