李玉玲，趙夢婧，李瑞可，張亞楠，吳秀山，袁婺洲

（湖南師范大學生命科學學院心臟發(fā)育研究中心，長沙 410081）

黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）是一種雙翅目昆蟲，具有生活史短、繁殖迅速、易于人工飼養(yǎng)、染色體少、突變性狀多等優(yōu)點。作為一種常見的模式生物，果蠅在現(xiàn)代生態(tài)學、群體生物學、行為學、系統(tǒng)學、遺傳學、發(fā)育生物學和分子生物學等研究領(lǐng)域都被廣泛的應用［1］，特別是在遺傳學、胚胎發(fā)育基因調(diào)控的研究中起著非常重要的作用。果蠅心臟發(fā)育過程與人類的心臟發(fā)育過程及調(diào)控機制有著密切的關(guān)聯(lián)，研究果蠅心臟發(fā)育的調(diào)控機制能為認識人類先天性心臟病的發(fā)病機制和治療提供重要的線索［2-3］。

果蠅心臟位于胚胎背中線的表層下，呈線性管狀結(jié)構(gòu)，由具有收縮特性的心肌細胞和不能收縮的副心肌細胞組成［4-5］。Svp（seven-up）作為一種孤兒受體基因在類固醇受體家族中存在，它與果蠅復眼中的光感受器細胞、神經(jīng)細胞以及心臟前體細胞等細胞的分化存在聯(lián)系，并且Svp在心肌細胞和副心肌細胞中都具有一定的表達量［6-7］。果蠅Svp基因定位于染色體3R上，cDNA長度為846 bp，編碼282個氨基酸，是心臟發(fā)育的一種標記基因，但目前尚無用于科學研究的商用Svp抗體。本研究采用DNA免疫技術(shù)來快速制備Svp抗體，為研究心臟發(fā)育分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

DNA免疫是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體肌肉、皮下或者腹腔等部位，利用宿主的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)合成外源目標蛋白抗原，從而誘導特異性的免疫應答反應［8-9］。DNA免疫的應答強度取決于表達載體表達抗原的能力以及免疫接種的途徑。DNA導入方式常用肌肉注射，其優(yōu)點有：橫紋肌細胞中溶酶體和DNA酶的含量較低，使得導入的質(zhì)粒DNA能夠在宿主細胞中長久存在；被注射的DNA會以環(huán)型分子存在于肌肉細胞中，使得其在宿主細胞中得不到復制，也不能整合到宿主細胞的染色體中；肌肉細胞外空間與其特有的橫管系統(tǒng)有著直接的通道，當DNA質(zhì)粒進入肌肉細胞后以胞吞作用的方式使外源目標蛋白抗原內(nèi)吞進入細胞［10-12］。前人的研究發(fā)現(xiàn)pCAGGS-P7真核表達載體具有很高的表達效率，該載體含有雞的β-actin啟動子和巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增強子，能使下游被插入基因在哺乳動物細胞中更高效表達，同時質(zhì)粒上具有KpnI、XhoI等多種方便目的基因插入的常見酶切位點［13-14］，故而被廣泛應用。本研究通過克隆果蠅Svp基因轉(zhuǎn)錄本NM_169459.2 CDS區(qū)域的284～846 bp的序列片斷，構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp，運用DNA免疫技術(shù)免疫小鼠，分離獲得免疫后血清，制備出多克隆抗體。胚胎免疫熒光以及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）鑒定檢測等試驗結(jié)果表明，該方法所制備的Svp多克隆抗體具備特異性，且效價較高，達到了果蠅心臟發(fā)育候選基因后續(xù)功能研究的應用標準。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、小鼠以及主要試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞DH5α、真核表達載體pCAGGS-P7、野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）W1118為湖南師范大學心臟發(fā)育研究中心試驗室保存；野生型昆明白小鼠（Mus musculus）購自湖南斯萊克景達試驗動物有限公司；2種限制性內(nèi)切酶XhoI、KpnI以及連接酶均購自美國Thermo Fisher公司；高保真酶試劑盒購自唯贊公司；DNA純化回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京自康為世紀生物公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

通過NCBI網(wǎng)站搜索果蠅Svp基因的cDNA序列，導入到Primer5.0軟件設(shè)計一對引物Sqe1、Resqe1，預期擴增長度為563 bp的Svp基因片段，并在引物的5'端上加了同源臂序列位點，使得插入片段在5'和3'端分別帶有與線性化的質(zhì)粒序列相同的同源臂。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物如下（下劃線序列為限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI識別位點）：

Sqe1：5'CTATAGGGCGAATTGGGTACCAGAACA TACCCTTCTTCCCG3'

Re-sqe1：5'ATCGATACCGTCGACCTCGAGTCAC ATCGAAGGCAGATAGG3'

1.3 構(gòu)建pCAGGS-P7-Svp重組表達質(zhì)粒

首先從W1118野生型黑腹果蠅胚胎中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以 cDNA 為模板用上述 Sqe1、Resqe1為引物，進行高保真PCR擴增，成功擴增出長為563 bp的Svp基因部分序列。反應條件為：95℃ 30 s預變性1個循環(huán)，95℃ 30 s 變性，44～60℃ 15 s 復性，72℃ 60 s延伸32個循環(huán)，72℃ 5 min 1 個循環(huán)，4℃ 保存。所得PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳回收制備，并與用限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI雙酶切回收的約 5 000 bp的pCAGGS-P7線性載體相連接。一步克隆連接體系為：10μL ddH2O + 4μL 5×CEII Buffer + 2 μL ExnaseII +3μL含同源臂的SvpDNA片段 + 1μL線性化載體。37℃恒溫水浴循環(huán)器中連接2 h。

1.4 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定

將Svp片段與pCAGGS-P7載體連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基篩選、挑取單克隆菌落，于液體培養(yǎng)基中37℃、220 r/min培養(yǎng)7 h。以Sqe1、Re-sqe1為引物，菌液為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證，再以雙酶切法和測序法鑒定，確定獲得重組質(zhì)粒為pCAGGS-P7-Svp陽性克隆。

1.5 DNA免疫技術(shù)制備小鼠抗體

用重組質(zhì)粒免疫4～6周齡昆明白小鼠：試驗組5只小鼠，分別在其后肢股四頭肌注射700μg/L的重組質(zhì)粒，每只小鼠注射40μL。注射完畢后立即在注射部位兩側(cè)5 mm處用細胞融合轉(zhuǎn)基因儀（electro cell manipulator）兩端電極電擊2次，讓質(zhì)粒DNA盡快擴散均勻。同時用pCAGGS-P7空載質(zhì)粒DNA等量注射5只小鼠作為對照組。注射時間為第0、21、28 天，共免疫3次，每次免疫的劑量與免疫方式相同，于免疫后第35 天取血并分離收集血清，添加1%疊氮化鈉后分裝，儲存于-80℃冰箱備用。

1.6 考馬斯亮藍染色及Western blot檢測Svp多克隆抗體效價

收集過夜果蠅胚胎100枚/管，液氮迅速冷凍后用組織研磨棒充分研磨，加入100μL的RIPA裂解液（RIPA lysis buffer），再添加 1μL蛋白酶抑制劑混勻，低溫離心機13 000 r/min離心10 min，收集上清液于冰上靜置1 h，充分裂解細胞。加入25μL上樣緩沖液，沸水煮10 min使蛋白變性，置于冰上冷卻備用。根據(jù)預測的目的蛋白的大小配制10%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質(zhì)，切取部分含有Marker蛋白以及樣品的凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色過夜。然后，倒出染色液，加入適量考馬斯亮藍洗脫液，確保洗脫液可以充分覆蓋凝膠。將其置于水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色4～24 h，期間更換洗脫液2～4次，直至藍色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預期。完成脫色后，將其用雙蒸水（double distilled water，ddH2O）浸泡，最后掃描得到果蠅全蛋白的考馬斯亮藍染色圖。使用濕轉(zhuǎn)的方式將電泳后的其他部分凝膠轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流進行。將轉(zhuǎn)完后的膜取出，配制5%脫脂牛奶封閉緩沖液（phosphate buffered saline TWEEN-20，PBST），在室溫下孵育2 h。封閉結(jié)束后，配制不同濃度的Svp多克隆抗體，4℃孵育過夜，然后用PBST以8 min/次漂洗3次。漂洗結(jié)束后加入1:2 000稀釋的鼠二抗在室溫下孵育2 h，PBST搖洗3次，每次8 min。清洗結(jié)束后，利用化學發(fā)光劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影以檢測抗體的效價及目的蛋白的表達水平。

1.7 免疫熒光檢測Svp多克隆抗體特異性

收集9～15 h野生型黑腹果蠅W1118的胚胎，用毛筆輕輕將果蠅胚胎刷到300目過濾網(wǎng)紗布上，清水漂洗3次。然后將胚胎浸泡于30%次氯酸鈉溶液中約4 min，脫去胚胎表層絨毛膜，在顯微鏡下觀察到胚胎觸角消失即為脫膜成功。脫膜成功后立即用清水漂洗胚胎5次，用配制好的胚胎固定液在室溫搖床孵育20 min以固定胚胎。去除固定液下層液體，加入5 mL甲醇后立即震蕩胚胎1 min脫去卵黃膜，靜置1 min后，去除上層液體，加入1 mL甲醇溶液漂洗胚胎，重復3次。最后，胚胎保在1 mL甲醇溶液中，-20℃保存。

取50μL固定好的胚胎于一只新離心管中，甲醇漂洗1次；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；500μL 添加了牛血清蛋白的PBST室溫封閉1 h；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；加500μL 1:100 PBST稀釋的Svp一抗和空白血清同時進行試驗，4℃搖床孵育過夜；500μL PBST漂洗3次，每次8 min；加500μL按適當比例稀釋后的熒光二抗，室溫避光孵育2 h；500μL PBST漂洗胚胎3次，每次8 min；將胚胎轉(zhuǎn)移至載玻片，70%甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp的構(gòu)建及鑒定

如圖1所示，以Sqe1、Re-sqe1為引物，PCR擴增得到約563 bp的Svp條帶，1～5泳道分別為44℃、48℃、52℃、56℃、60℃復性溫度下的PCR結(jié)果，結(jié)果顯示56℃的復性溫度擴增效果最好。如圖2a 中pCAGGSP7-Svp重組質(zhì)粒示意圖所示，將pCAGGS-P7載體用KpnI、XhoI酶切，得到線性目的載體帶，然后將Svp目的帶連接到pCAGGS-P7質(zhì)粒的KpnI、XhoI酶切位點之間，獲得重組質(zhì)粒pCAGGS-P7-Svp。如圖2b所示，將重組pCAGGS-P7-Svp用KpnI、XhoI進行單酶切以及雙酶切驗證，在563 bp的Svp片段中也存在著1個XhoI酶切位點，所以在用XhoI單酶切時有2條帶，KpnI、XhoI雙酶切時有3條帶。最后將菌液提取質(zhì)粒測序，進行核苷酸測序比對，結(jié)果表明pCAGGS-P7-Svp重組質(zhì)粒的Svp序列與NCBI上Svp序列一致。以上結(jié)果表明pCAGGS-P7-Svp重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Svp基因 PCR擴增電泳圖Fig.1 Svp gene PCR amplification electropherogram

2.2 Western blot鑒定Svp多克隆抗體效價

圖2 pCAGGS-P7-Svp 重組質(zhì)粒示意圖和酶切圖Fig.2 Schematic diagram of pCAGGS-P7-Svp recombinant plasmid and enzyme digestion result

收集野生型果蠅胚胎，提取總蛋白。如圖3a為考馬斯亮藍染色的果蠅總蛋白圖。分別以1:100，1:200，1:400，1:600，1:800比例稀釋后的Svp多克隆抗體作為一抗進行了Western blot檢測，結(jié)果如圖3b所示。Svp多克隆抗體在各稀釋比例下都出現(xiàn)了一條76 kD的特異性條帶，說明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了效價高的Svp蛋白的特異性抗體。而用免疫前血清以1:100稀釋作為一抗進行檢測，未見特異性條帶。說明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了Svp蛋白的特異性抗體，該抗體的特異性和敏感性良好，可以滿足今后試驗的需求。

2.3 Svp多克隆抗體免疫熒光鑒定

用野生型黑腹果蠅胚胎進行免疫熒光試驗，對照組為免疫前血清的免疫熒光胚胎染色，試驗組為用Svp多克隆抗體對9～15 h的野生型果蠅胚胎染色。對比Flybase數(shù)據(jù)，已知在理論上Svp蛋白會在果蠅胚胎背腹軸中線部位的部分心肌細胞和副心肌細胞表達，本試驗結(jié)果顯示的Svp表達圖式也在背中線心臟細胞中表達，表明本研究制備的Svp多克隆抗體效價高。

圖3 Western blot鑒定抗體效價Fig.3 Identification of antibody by Western blot

圖4 Svp多克隆抗體免疫熒光鑒定（×200）Fig.4 Immunofluorescence identification of Svp polyclonal antibody (×200)

3 討論

Svp作為一個果蠅心臟發(fā)育的標記基因，其特異性抗體對果蠅心臟發(fā)育研究有著重要作用。但鑒于目前無Svp的商用抗體，所以本研究采用DNA免疫技術(shù)，在降低成本的同時制備出高效價、特異性好的Svp抗體。將基因重組技術(shù)獲得的編碼Svp抗原蛋白的外源DNA直接注射進小鼠肌肉，并電擊導入細胞內(nèi)，使外源DNA在宿主細胞中表達合成免疫原性蛋白。在1個月內(nèi)多次注射，加強免疫應答，分離并收集免疫后血清制備好抗體。然后用Western blot試驗以及免疫熒光試驗鑒定血清的效價和特異性，結(jié)果表明制備的Svp多克隆抗體能與果蠅體內(nèi)表達的Svp蛋白結(jié)合，且特異性較好，這為今后進一步研究Svp基因的生物學功能提供了重要的研究材料。

相較于傳統(tǒng)免疫技術(shù)而言，DNA免疫是通過直接引起機體對外源蛋白產(chǎn)生免疫反應的免疫技術(shù)。DNA免疫能在自身細胞中合成外源性蛋白，使抗原在活體內(nèi)產(chǎn)生，在一些結(jié)構(gòu)復雜或難以表達的蛋白（如膜蛋白）抗體的制備過程中能有效節(jié)省免疫原的生產(chǎn)和純化時間，且其表達出的蛋白結(jié)構(gòu)更加接近于天然分子，有助于生產(chǎn)高親和力的抗體［15-16］。同時，這種免疫技術(shù)采用肌肉注射，進入體內(nèi)的微量抗原一旦被肌細胞攝取，存在的半衰期延長，不斷合成的外源蛋白持續(xù)性地刺激免疫系統(tǒng)，進而能加強免疫細胞的記憶持久性。最后，DNA免疫操作方法簡便，僅需在構(gòu)建高效表達質(zhì)粒后直接接種免疫小鼠，不需要進行抗原提取和蛋白純化步驟［17-18］，進而時間會更短、價格更低廉。而相比于單克隆抗體而言，本研究采用的DNA免疫技術(shù)制備的多克隆抗體能識別任一抗原上的多個表位，有助于放大低表達水平的靶蛋白信號，因此在免疫檢測中，可以識別更多的抗原，也較少受到抗原構(gòu)象變化的影響［19-20］。因此，在相同條件下，利用多克隆抗體可以提高檢測的靈敏度，從而在Western blot等檢測試驗中得到更好的結(jié)果。