劉靜華，陳慶澤，范凱青，馬譽旗，鄭 純，劉 主

（韶關學院 英東生物與農業(yè)學院，廣東 韶關 512005）

生物信息學是一門由分子生物學和計算機信息處理技術結合的，以計算機為工具讀取生物信息并進行儲存、檢索和分析的交叉學科.生物信息學作為一門嶄新的交叉學科，在如火如荼的發(fā)展中，吸引了越來越多生物學、醫(yī)學、數學以及具有信息科學背景的專家學者投入其研究當中.近年來，生物信息學的主要研究重點在序列比對、蛋白質結構比對和預測、基因識別非編碼區(qū)分析、分子進化和比較基因組學、序列重疊群（Contigs）裝配、遺傳密碼的起源、基于結構的藥物設計、生物系統(tǒng)的建模和仿真、生物信息學技術方法的研究、生物圖像等方面.本文運用生物信息學軟件進行ITS序列對比分析，研究草菇的系統(tǒng)分類.

1 草菇的傳統(tǒng)系統(tǒng)分類及ITS序列系統(tǒng)分類

草菇別名稻草菇、美味苞腳菇、蘭花菇、稈菇、貢菇以及中國菇等.草菇起源于廣東韶關南華寺，距今已有300多年的歷史.在植物分類學上，草菇屬擔子菌綱傘菌目是公認的，但關于草菇的科屬問題仍存在不同的意見.當前主要有3種不同的分類意見：一是鄧樹群和張樹庭分別把草菇分在鵝膏科苞腳菇屬和小苞腳菇屬中；二是魏景超則將其歸類于傘菌科中；三是Ainsworth等、Singer和Pegler以及畢志樹等，主張將其分在光柄菇科的小苞腳菇屬，這種說法為現在多數學者所主張［1］.但傳統(tǒng)的真菌分類方法是以真菌的形態(tài)學特征、生長特征、以及生理生化指標為基礎，這些標準分類方法通常需要較長的時間，要進行大量的形態(tài)學觀察和繁瑣的生理生化試驗.某些真菌屬、種之間的形態(tài)學或生理生化差異極其不顯著，而且形態(tài)特征有時還會受環(huán)境因素的影響，采用傳統(tǒng)的方法對這些真菌進行分類鑒定是比較困難且準確性較低的.近年來，隨著現代分子生物技術和生物信息學等相關技術的發(fā)展，運用現代分子生物技術和生物信息學軟件對食用菌的單一科、屬、種的鑒定研究頗為熱門［2-3］.目前應用于真菌分類研究的分子生物學技術主要有限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RELP）［4］、DNA 擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）［5］和核糖 rDNA 內部轉錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析技術［6］、擴增多態(tài)性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）［7］等 .研究表明，ITS片段的進化速率是18S rDNA的10倍.這是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎［8-9］.ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現為種內相對一致，種間差異比較明顯.這種特點使ITS適合于菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析.而且ITS的序列分析能實質地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，此外ITS序列片段較小，易于分析，目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中［10-15］.

本文主要利用ClustalX、MEGA5.0等生物信息學軟件對草菇及其相近種屬的物種進行ITS序列對比分析.考慮到用不同的方法分析一個數據集，如果能產生相似的發(fā)育樹，則比較可靠，從而選擇了距離法中的Minimum Evolution最小進化法（ME）、Neighbor-Joining鄰接法（NJ）；特征法中的Maximum likelihood最大擬然法（ML），分別建立系統(tǒng)發(fā)育樹，從而驗證其科屬分類問題.

2 材料與方法

2.1 實驗材料的序列來源

全部序列來源于美國國立生物技術信息中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的GENBANK數據庫.本研究采用4個不同科中的8個屬共29條序列材料，具體情況見表1.

表1 NCBI所獲得的ITS序列

2.2 研究方法

將從GenBank上所獲得的ITS序列（表1），通過序列分析軟件BioEdit對其進行編輯，采用多重序列比對軟件Clustal X軟件進行多序列比對.系統(tǒng)發(fā)育樹的構建和系統(tǒng)發(fā)育研究分析則用MEGA 5.0和PAUP軟件，利用Construct Tree中的Neighbor-Joning（NJ）構建NJ樹，Maximum-likehihood（ML）構建ML樹，Minimum-Evolution（ME）構建ME樹.以球蓋科的兩個物種為外群，并用Bootstrap自展檢驗1 000次分析分支聚類的穩(wěn)定性［3］.

3 結果與分析

3.1 ME樹及NJ樹

最小進化法（ME法）、鄰接法（NJ法）同屬距離法，當序列同源對比相似度不高，但可判斷具有相似性時，推薦選擇這兩種方法.距離法體現的是序列間的相似程度.圖1為依據ME法構建的ME樹，圖2為依據NJ法構建的NJ樹.

圖1 Minimum-Evolution（ME）樹

圖2 Neighbor-Joining（NJ）樹

從圖1中ME樹可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞腳菇屬（Volvariella）的分支上，它與小苞腳菇屬內其它物種的相似性達84%以上，其中與銀絲草菇（Volvariella bombycina）聚成一個分支，兩者相似性達99%以上；草菇與小苞腳菇屬中的物種親緣關系比較近.傘菌科的蘑菇屬（Agaricus）和大環(huán)柄菇屬（Macrolepiota）匯成一個分支，光柄菇屬（Pluteus）和鵝膏屬（Amanita）的物種則獨立形成一個分支.草菇與鵝膏科的部分物種如Limacella glioderma（茶色粘傘）、Amanita virosa（鱗柄白鵝膏）的親緣關系比較近，相似性達66%，跟光柄菇科的光柄菇屬則親緣關系比較遠，相似性僅31%.

從圖2的NJ樹可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞腳菇屬（Volvariella）的分支上，它與小苞腳菇屬內各種的相似性達87%以上，其中與銀絲草菇的相似性達99%以上；傘菌科的蘑菇屬（Agaricus）和大環(huán)柄菇屬（Macrolepiota）匯成一個分支，光柄菇屬（Pluteus）的所有物種獨立形成一個分支.草菇與鵝膏科的部分物種如Limacella glioderma（茶色粘傘）、Amanita virosa（鱗柄白鵝膏）的親緣關系比較近，相似性達61%，跟光柄菇科的光柄菇屬則親緣關系比較遠，相似性僅33%.

3.2 ML樹

最大擬然法（ML法）屬于特征法，當序列同源對比相似度不高，但不能明顯判斷是否具有相似性時，推薦選擇這種方法.ML法不計算序列間的距離，而是將序列中有差異的位點作為單獨特征，根據這些特征來建樹.從圖3的ML樹可知，草菇（Volvariella volvacea）位于小苞腳菇屬（Volvariella）的分支上，它與小苞腳菇屬內其它物種的相似性達82%以上，其中與銀絲草菇（Volvariella bombycina）聚成一個分支，兩者相似性達96%以上；草菇與小苞腳菇屬中的物種親緣關系比較近.傘菌科的蘑菇屬（Agaricus）和大環(huán)柄菇屬（Macrolepiota）匯成一個分支，光柄菇屬（Pluteus）種則獨立形成一個分支.草菇與鵝膏科的部分物種如Limacella glioderma（茶色粘傘）、Amanita virosa（鱗柄白鵝膏）的親緣關系比較近，相似性達65%，跟光柄菇科的光柄菇屬則親緣關系比較遠，相似性僅41%.

圖3 Maximum-likehihood（ML）樹

4 結論

本文采用生物信息學軟件對草菇及其近緣種的親緣關系進行ITS序列分析，并由此構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育研究.根據NJ、ME和ML法所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹所得出的結果大致相同，均將草菇歸類于小苞腳菇屬較為合理，隸屬于擔子菌門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）光柄菇科（Pluteaceae）.