李 彬, 張 賽, 王晨蕊, 王桂榮, 劉 楊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193)

綠盲蝽Apolyguslucorum是我國黃河流域和長江流域?yàn)楹γ藁ǖ膬?yōu)勢(shì)盲蝽種類，具有包括棉花、玉米、葡萄、棗、蔬菜等農(nóng)作物在內(nèi)的200多種寄主植物，對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的破壞。自1997年轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在我國商業(yè)化種植以來，化學(xué)農(nóng)藥使用量大幅度減少，一方面增加了天敵昆蟲的種類和數(shù)量，加強(qiáng)了部分害蟲的自然調(diào)控作用，有效地控制了棉蚜的種群發(fā)展(Luetal., 2012)，另一方面天敵控制作用較差的害蟲如綠盲蝽上升為主要害蟲(Luetal., 2010)。綠盲蝽種群的暴發(fā)還波及其他寄主作物, 近年來在各類果樹、茶樹等其他作物上為害也十分嚴(yán)重。雖然近年間人們致力于利用生態(tài)學(xué)和生物防治等手段對(duì)綠盲蝽進(jìn)行綜合防治，但由于綠盲蝽具有寄主范圍廣、寄主轉(zhuǎn)換行為、高遷移性等獨(dú)特的生物學(xué)特性，造成這些防治措施并沒有達(dá)到最佳效果(Lu and Wu, 2011)。目前我國對(duì)綠盲蝽的防控還主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，如何綠色防治綠盲蝽仍然是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的重要科學(xué)問題。

植物揮發(fā)物在植物與昆蟲的通訊作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以調(diào)控昆蟲的多種行為，如引起昆蟲對(duì)寄主植物的定向選擇，引導(dǎo)昆蟲尋找合適的產(chǎn)卵場所，影響昆蟲的交配行為等(杜家緯, 2001)。昆蟲對(duì)寄主植物的定向選擇是植物與昆蟲相互依存關(guān)系中最重要的行為之一。昆蟲通過自身的視覺器官、味覺器官、觸覺器官和嗅覺器官等各種感覺系統(tǒng)不斷收集來自植物的各種信息，從形狀、顏色、大小、化學(xué)性質(zhì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面對(duì)植物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最后做出寄主選擇(陸宴輝等, 2008)。在昆蟲諸多的感覺系統(tǒng)中靈敏的嗅覺系統(tǒng)發(fā)揮了決定作用。昆蟲主要通過對(duì)寄主植物揮發(fā)的氣味分子的識(shí)別來對(duì)寄主植物識(shí)別和定位。因此，準(zhǔn)確了解昆蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物的識(shí)別機(jī)制不僅可以在理論上闡明昆蟲嗅覺識(shí)別高度特異性的分子和神經(jīng)基礎(chǔ)，在應(yīng)用上還可以開發(fā)昆蟲行為調(diào)控劑用于害蟲的綠色防控。

昆蟲的嗅覺識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜的過程，在外周神經(jīng)水平上主要通過分布在觸角上嗅覺感器中的一系列蛋白參與來完成，這些蛋白包括氣味受體(odorant receptor, OR)、氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)、離子型受體(ionotropic receptor, IR)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)、尼曼匹克C2蛋白(Niemann-Pick proteins of class C2, NPC2)和氣味降解酶(odorant degrading enzyme, ODE)(Rutzler and Zwiebel, 2005; de Bruyne and Baker, 2008; Sato and Touhara, 2008; Zhuetal., 2018)，其中氣味受體發(fā)揮了核心作用。目前已知的昆蟲氣味受體分為2類：第1類為在不同昆蟲間高度保守且廣泛表達(dá)的非典型受體(olfactory receptor co-receptor, Orco)；第2類為種間高度變異的傳統(tǒng)氣味受體(conventional odorant receptor, Orx)(Mombaerts, 1999; Bentonetal., 2006)。Orx不單獨(dú)對(duì)氣味分子起識(shí)別作用，而是與Orco形成異源多聚體(Butterwicketal., 2018)，共同將環(huán)境中的小分子化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，使嗅覺神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，最終引起昆蟲作出相應(yīng)的行為活動(dòng)(Larssonetal., 2004)。自1999年首次從黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定出昆蟲氣味受體以來，伴隨著一些模式昆蟲基因組數(shù)據(jù)的公布，一系列昆蟲氣味受體基因家族被鑒定出來。包括從果蠅基因組中鑒定出62個(gè)氣味受體基因(Clyneetal., 1999; Gao and Chess, 1999; Vosshalletal., 1999)。在家蠶Bombyxmori中鑒定出48個(gè)氣味受體基因(Sakuraietal., 2004; Nakagawaetal., 2005; Wanneretal., 2007)。隨著氣味受體基因陸續(xù)被鑒定，研究者們已經(jīng)從分子和細(xì)胞層面展開對(duì)昆蟲氣味受體功能的一系列研究。

研究綠盲蝽的氣味受體，有利于我們從分子層面深入了解綠盲蝽對(duì)寄主植物的嗅覺識(shí)別機(jī)制，為研制高效的引誘劑或驅(qū)避劑提供理論依據(jù)并開辟新途徑。在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，已通過綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析獲得多條綠盲蝽氣味受體基因序列。本研究中我們篩選并克隆了其中8個(gè)綠盲蝽氣味受體基因，并對(duì)其表達(dá)模式和功能進(jìn)行了研究，為研究綠盲蝽對(duì)寄主植物的識(shí)別機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與組織收集

實(shí)驗(yàn)所用的綠盲蝽采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊試驗(yàn)基地，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室中使用新鮮四季豆Phaseolusvulgaris和鮮食玉米Zeamays在塑料盒內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為28±1℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光周期為16L∶8D。收集羽化3 d的綠盲蝽雌雄成蟲觸角、頭(無觸角)、胸、腹、足和翅6種組織，用液氮迅速冷凍，儲(chǔ)存于-70℃冰箱內(nèi)備用。以相同方式收集3組不同批次的昆蟲各組織樣品。

1.2 RNA提取與cDNA的合成

使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)按照說明書提取1.1節(jié)3組不同批次綠盲蝽雌雄成蟲6種組織(觸角、無觸角的頭、胸、腹、足和翅)的總RNA。每組觸角、頭(無觸角)、胸、腹、足和翅的總RNA分別取自100，50，20，20，80和80頭羽化3 d的綠盲蝽成蟲。提取的總RNA通過NanoDrop 2000(NanoDrop Products，美國)來檢測(cè)濃度和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)質(zhì)量。取2 μg各個(gè)組織的RNA，以O(shè)ligo dT為引物，合成cDNA第1鏈，實(shí)驗(yàn)操作依照First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美國)使用手冊(cè)。此cDNA用作PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)的模板。

1.3 引物設(shè)計(jì)

基于實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序和分析，我們選擇具有完整開放閱讀框的AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58進(jìn)行基因克隆和功能驗(yàn)證。在qPCR實(shí)驗(yàn)中，選用綠盲蝽的持家基因AlucActin(GenBank登錄號(hào): KU188517.1)為內(nèi)參基因(張志翔等, 2016)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆和qPCR引物，全部引物信息見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物信息

1.4 基因克隆

以綠盲蝽觸角cDNA為模板，利用基因克隆特異性引物擴(kuò)增AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57,AlucOR58以及AlucOrco(GenBank登錄號(hào): MN657161)的完整開放閱讀框序列。PCR反應(yīng)體系: 2×PrimeStar Mix 12.5 μL(含Mg2+)，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，加水至25 μL。在震蕩器上混勻，短暫離心，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。其反應(yīng)條件: 98 ℃預(yù)變性3 min; 98℃ 變性10 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸90 s, 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并將條帶進(jìn)行膠回收。將回收后的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)上，然后轉(zhuǎn)入Trans-1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)內(nèi)，進(jìn)行測(cè)序(華大基因，北京)。

1.5 序列分析

使用EXPASY(Expert Protein Analysis System)(http:∥www.expasy.org)的Translate tool(http:∥web.expasy.org/translate)將8條氣味受體基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。使用TOPCONS(http:∥topcons.net)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用DNAMAN(http:∥www.lynnon.com)軟件將AlucOR9, AlucOR16, AlucOR38, AlucOR53, AlucOR55, AlucOR56, AlucOR57和AlucOR58 的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 qPCR檢測(cè)

利用qPCR檢測(cè)AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58的表達(dá)水平。采用2×Go Taq qPCR Master Mix(Promega, 美國)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀iCycler iQ2(Bio-Rad，美國)上進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系: 2×Go Taq qPCR Master Mix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 1.2節(jié)合成的cDNA 模板1 μL, RNase-free Water 8 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性15 s, 60℃退火1 min, 40個(gè)循環(huán)。所有樣品均使用獨(dú)立的RNA進(jìn)行3次重復(fù)，內(nèi)參基因AlucActin。通過2-ΔΔCt值法來比較各個(gè)基因不同組織的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式如下: ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因; ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參照物。得到的3套模板的2-ΔΔCt值作圖，并比較基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 表達(dá)載體構(gòu)建和cRNA合成

將測(cè)序結(jié)果正確的各AlucOR基因經(jīng)ApaⅠ和NotⅠ雙酶切后，亞克隆到表達(dá)載體pT7Ts上(體系為6 μL雙酶切后的基因片段, 1 μL 10×T4 Ligase Buffer, 2 μL 雙酶切過的pT7Ts 載體和1 μL T4 Ligase，連接條件為22℃保持2 h)，連接體系轉(zhuǎn)入Trans-1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)內(nèi)。過夜培養(yǎng)后，挑取8個(gè)陽性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，然后測(cè)序。驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，使用SmaⅠ進(jìn)行單酶切質(zhì)粒線性化，利用mMESSAGE mMACHINET7(Ambion，美國)進(jìn)行cRNA的合成。

1.8 氣味化合物

實(shí)驗(yàn)中共使用56種氣味化合物，均來自百靈威和Sigma-Aldrich公司(純度≥95%)，見表2。實(shí)驗(yàn)所用氣味化合物首先用DMSO配制成1 mol/L的儲(chǔ)備液，存儲(chǔ)在-20℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)前，使用1×Ringer(96 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 5 mmol/L MgCl2, 0.8 mmol/L CaCl2和5 mmol/L HEPES, pH 7.6)溶液稀釋到濃度為10-4mol/L。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，每次實(shí)驗(yàn)所用氣味化合物均是現(xiàn)用現(xiàn)配。

表2 本研究所用氣味化合物

1.9 爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)結(jié)合雙電極電壓鉗記錄

爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)和雙電極電壓鉗記錄方法參照前人的使用方法(Luetal., 2007; Wangetal., 2010)。將合成好的濃度為2 μg/μL的AlucOR和AlucOrcocRNA各1 μL混勻到一起，按照每個(gè)細(xì)胞注射27.6 nL的量注射到健康且成熟的爪蟾卵母細(xì)胞中。將注射好的爪蟾卵母細(xì)胞放在培養(yǎng)液(1×Ringer, 5% 馬血清，50 μg/mL四環(huán)素，100 μg/mL鏈霉素和50 μg/mL丙酮酸鈉)中以18℃恒溫培養(yǎng)3 d。然后用OC-725C雙電極電壓鉗(Warner，美國)記錄爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)不同氣味揮發(fā)物刺激的反應(yīng)。通過數(shù)模轉(zhuǎn)化器Digidata 1440A和軟件pCLAMP 10.2(Axon，美國)獲取和分析具體的數(shù)據(jù)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，雌雄各組織之間表達(dá)量的差異采用SAS軟件LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，利用one-way ANOVA的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 綠盲蝽氣味受體基因的克隆和序列分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析所得的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性克隆引物，克隆得到AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58的cDNA全長序列(GenBank登錄號(hào): MN905538-MN905545)。這8個(gè)氣味受體基因的開放閱讀框全長范圍在1 131～1 312 bp，編碼376～437個(gè)氨基酸。利用TOPCONS預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)8個(gè)氣味受體均具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N末端位于細(xì)胞膜內(nèi)，C末端位于細(xì)胞膜外(圖1)。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這8個(gè)氣味受體基因的氨基酸序列一致性在11.63%～64.23%。

2.2 8個(gè)氣味受體基因在綠盲蝽雌雄成蟲不同組織中的表達(dá)譜

利用qPCR方法檢測(cè)8個(gè)氣味受體基因在綠盲蝽雌、雄成蟲不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，這8個(gè)氣味受體基因均在成蟲觸角中高表達(dá)；除AlucOR38外，其他7個(gè)氣味受體基因在雌成蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲中的(P<0.05)(圖2)。

圖2 8個(gè)綠盲蝽氣味受體基因在成蟲組織中的表達(dá)譜

2.3 8個(gè)綠盲蝽氣味受體的功能分析

在爪蟾卵母細(xì)胞中分別將8個(gè)AlucOR分別與AlucOrco進(jìn)行共表達(dá)，用雙電極電壓鉗系統(tǒng)記錄AlucOR/AlucOrco對(duì)共計(jì)56種測(cè)試氣味化合物的電生理反應(yīng)。電壓鉗記錄結(jié)果顯示，AlucOR57/AlucOrco對(duì)其中15種氣味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氫芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反應(yīng)(圖3)，對(duì)其余的氣味化合物無反應(yīng)；其他7個(gè)綠盲蝽氣味受體對(duì)56種測(cè)試氣味化合物均無反應(yīng)。

圖3 雙電極電壓鉗記錄的爪蟾卵母細(xì)胞共表達(dá)AlucOR57/AlucOrco對(duì)不同氣味化合物的反應(yīng)

3 討論

本研究克隆得到了8個(gè)綠盲蝽氣味受體的完整ORF序列，序列分析的結(jié)果顯示這8個(gè)氣味受體具有昆蟲氣味受體典型的結(jié)構(gòu)特征(Bentonetal., 2006; Leal, 2013)。序列比對(duì)的結(jié)果顯示綠盲蝽8個(gè)氣味受體的氨基酸序列一致性非常低，這一結(jié)果符合昆蟲氣味受體序列高度特異性的特征，也與我們以前關(guān)于綠盲蝽氣味受體的研究結(jié)果一致，暗示綠盲蝽的不同氣味受體在功能上也可能存在較大差異(Yanetal., 2015)。

氣味受體的功能與其表達(dá)模式具有密切的聯(lián)系(Kriegeretal., 2002; Legeaietal., 2011)，因此不同氣味受體在組織表達(dá)模式上存在很大差異。性信息素受體一般在雄蟲觸角內(nèi)高表達(dá)或特異性表達(dá)，而普通氣味受體的表達(dá)模式則變化很大。一些氣味受體可能在雌蟲觸角上高表達(dá)或特異表達(dá)，例如家蠶的BmOR19, BmOR30, BmOR45和BmOR47都在雌蟲觸角中高表達(dá)，且能識(shí)別芳樟醇、苯甲酸、2-苯乙醇和苯甲醛等植物揮發(fā)物，推測(cè)其可能參與雌蟲對(duì)產(chǎn)卵場所的選擇(Andersonetal., 2009)。很多氣味受體在雌雄成蟲觸角間具有相同的表達(dá)水平，如苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus的AlinOR8在雌雄成蟲觸角中均高表達(dá)，且對(duì)7種酯類、芳香族和醇類化合物有反應(yīng)，因此推測(cè)其可能參寄主植物的選擇(嚴(yán)曙瑋, 2015)。某些氣味受體還在觸角之外的其他組織中表達(dá)。qPCR結(jié)果(圖2)顯示8個(gè)綠盲蝽氣味受體基因均在觸角中高表達(dá)，暗示它們參與了綠盲蝽的嗅覺識(shí)別過程；而不同氣味受體基因在雌雄觸角中的表達(dá)存在明顯不同，雖然8個(gè)氣味受體基因在雌雄觸角中的表達(dá)量都很高，但其中7個(gè)氣味受體基因在雌蟲觸角中表達(dá)量均高于雄蟲觸角中的，暗示它們可能在雌蟲的嗅覺感受中發(fā)揮重要的作用。

利用爪蟾卵母細(xì)胞異源表達(dá)結(jié)合雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)，我們檢測(cè)了8個(gè)綠盲蝽氣味受體對(duì)56種氣味化合物的反應(yīng)。結(jié)果顯示只有AlucOR57對(duì)15種氣味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氫芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反應(yīng)，而其余7個(gè)氣味受體對(duì)這56種氣味化合物均無反應(yīng)(圖3)。AlucOR57可以識(shí)別的15種氣味化合物組分包括多種已知的綠盲蝽寄主植物揮發(fā)物，如潘洪生(2013)從綠盲蝽寄主植物的花期揮發(fā)物中鑒定出了2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯，這兩種化合物可以激活綠盲蝽雌雄成蟲觸角的電生理反應(yīng)。2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯混合物(3∶1)在田間對(duì)綠盲蝽顯示出很好的誘集效果(潘洪生等, 2014)。而對(duì)于綠盲蝽的近緣物種中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、苜蓿盲蝽和三點(diǎn)盲蝽Adelphocorisfasciaticollis，2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯也有顯著的吸引作用(修春麗, 2014)。AlucOR57對(duì)多種植物揮發(fā)物均有反應(yīng)，我們推測(cè)該受體可能參與綠盲蝽對(duì)寄主植物的識(shí)別和定位。但以上推測(cè)仍需要進(jìn)一步的RNAi或基因敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)功能和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

除AlucOR57以外，我們檢測(cè)的其他7個(gè)綠盲蝽氣味受體對(duì)檢測(cè)的56種氣味化合物均無反應(yīng)(圖3)，這可能是由于我們檢測(cè)的氣味數(shù)量較少，這7個(gè)氣味受體的配體不在檢測(cè)的范圍之中。此外，在昆蟲體內(nèi)氣味受體對(duì)氣味分子的識(shí)別還需要其他蛋白包括氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白、感覺神經(jīng)元膜蛋白以及NPC2蛋白的參與，而我們?cè)谶M(jìn)行體外功能檢測(cè)時(shí)并未加入這些蛋白，可能影響到氣味受體發(fā)揮其正常的功能。這幾個(gè)受體的具體功能如何，仍需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)本研究的結(jié)果，我們推測(cè)AlucOR57在綠盲蝽對(duì)寄主植物識(shí)別過程中發(fā)揮了重要功能，對(duì)此氣味受體的研究有助于我們進(jìn)一步了解綠盲蝽識(shí)別寄主植物的分子機(jī)制，為研發(fā)高效環(huán)保的綠盲蝽行為調(diào)控劑提供理論指導(dǎo)，為綠盲蝽的綜合防治提供新思路和新方法。