尹圓圓 馬華鈺 李昕怡 徐靜晨 柳汀 陳嵩 何姝姝

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院正畸科 成都 610041

正畸力加載至牙齒后，牙周膜與牙槽骨受到機械應(yīng)力產(chǎn)生應(yīng)變，通過一系列復(fù)雜的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將正畸力學信號轉(zhuǎn)換為細胞內(nèi)以及細胞之間的生物化學信號，從而產(chǎn)生細胞反應(yīng)引起牙槽骨的沉積與吸收，即牙槽骨塑建，使壓力側(cè)牙槽骨吸收而張力側(cè)牙槽骨沉積，最終牙齒得以在牙槽骨中移動[1-2]。正畸牙移動骨塑建的機械力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)控機制是正畸生物力學和生物學研究的熱點。

自噬是一種細胞內(nèi)基本的降解機制，通過溶酶體功能將細胞內(nèi)病原體和受損細胞器等進行降解和再循環(huán)[3]，其參與了細胞對環(huán)境或內(nèi)部刺激的應(yīng)答，在細胞正常生理活動（如調(diào)節(jié)細胞新陳代謝、生長、分化等）及許多疾病（如炎癥、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等）中均有重要作用[3-4]。近期研究[5-6]表明，自噬與骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，參與調(diào)控破骨細胞、成骨細胞、骨細胞等骨相關(guān)細胞的代謝，可能預(yù)示著骨穩(wěn)態(tài)紊亂相關(guān)疾病形成的新機制。然而，目前自噬在正畸牙移動骨塑建中的作用尚未得到充分闡明。本研究旨在通過建立小鼠正畸牙移動模型，觀察牙周組織中骨塑建和自噬相關(guān)基因水平的變化，為進一步探討自噬對正畸牙移動骨塑建的影響提供理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 11周齡健康雄性C57B/6小鼠30只，體重約30 g，由四川大學實驗動物中心提供。實驗通過四川大學倫理委員會審查（批號：WCHSIRB-D-2016-165），于口腔疾病研究國家重點實驗室完成實驗。30只小鼠隨機分為3組。

分組及對應(yīng)處置措施如下：A組加力組，10只小鼠，安放拉簧并施加矯治力；B組無力拉簧組，10只小鼠，安放拉簧但不加載力；C組全空白組，10只小鼠，無任何處置。

1.1.2 主要材料及儀器設(shè)備 0.12 mm鎳鈦螺旋拉簧（成都銘興彈簧有限公司，中國），0.2 mm結(jié)扎絲，Quantum FX μCT儀器（Perkin Elmer公司，美國），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（Sigma公司，美國），顯微攝像系統(tǒng)（Olympus公司，日本），Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)軟件（Media Cybernetics公司，美國），AQ131-01實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒、Trizol、RNA溶解液（北京全式金生物科技有限公司，中國），骨保護因子（osteoprotegerin，OPG）、破骨細胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、自噬相關(guān)基因（包括Atg5、Atg7、Beclin-1）PCR引物合成（上海生工生物工程有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 建立牙移動動物模型 小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為3.0 mL·kg-1。注藥后將小鼠置于22～25 ℃恒定環(huán)境中保持仰臥狀態(tài)，口內(nèi)放入自制開口器確保術(shù)野清晰。將定制的0.04 N螺旋拉簧拉伸至產(chǎn)生0.04 N力的長度，兩端用結(jié)扎絲分別結(jié)扎于左側(cè)上頜第一磨牙及左側(cè)上頜中切牙處。在切牙結(jié)扎絲處用光固化流動樹脂固定以增強固位（圖1）。加力11 d，每天檢查矯治器是否有脫落損壞并及時修復(fù)。所有小鼠在初戴裝置3 d內(nèi)輔以軟食，之后自由攝食。

1.2.2 標本制備 于加力第12 d采用注射過量水合氯醛的方式處死小鼠。常規(guī)解剖獲取上頜骨標本，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后放入包埋框并編號。將標本放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，固定后分別進行微計算機斷層掃描技術(shù)（microcomputed tomography，MicroCT）和RT-qPCR檢測。

圖1 建立小鼠牙移動模型Fig 1 Establishment of the tooth movement model

1.2.3 MicroCT檢測 每組選取3個樣本固定后進行MicroCT掃描，分別獲取橫截面和縱截面圖像。設(shè)置儀器相應(yīng)的掃描參數(shù)（XRay kV：90 kV，XRay μA：90 μA，F(xiàn)OV：7.68 mm，Pixel Size：15 μm）。通過文獻[7]回顧，將第一磨牙遠中外形最凸點和第二磨牙近中外形最凸點之間的距離記錄為第一磨牙牙移動距離，計算出每組均值。

1.2.4 石蠟切片制備 標本進行常規(guī)固定、脫鈣、脫水、浸蠟、包埋處理，將蠟塊標本沿磨牙牙體長軸進行近遠中向連續(xù)切片，每張厚約4 μm，進行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色和TRAP染色。

1.2.5 HE染色 每個樣本隨機選取1張切片按照常規(guī)步驟進行HE染色，觀察左側(cè)上頜第一磨牙牙根近遠中側(cè)根中1/3牙周組織形態(tài)學變化。

1.2.6 TRAP染色 每個樣本隨機選取切片2張，按TRAP試劑盒說明進行操作。分別在左側(cè)上頜第一磨牙遠中根近遠中側(cè)的根中1/3區(qū)域隨機選取2個視野觀察破骨細胞。

1.2.7 RT-qPCR檢測 取材后在每1 mL冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。每100 mg固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。再使用試劑盒進行擴增，反應(yīng)程序為：95 ℃，3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，20 min升溫，95 ℃ 15 s。引物序列如表1。采用2-ΔΔCT法對結(jié)果進行分析。

表1 小鼠PCR相關(guān)引物序列Tab 1 Primers for PCR analysis of mice

1.3 統(tǒng)計學分析

牙根近遠中側(cè)破骨細胞計數(shù)和qPCR數(shù)據(jù)采用軟件GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析。組內(nèi)對比采用配對t檢驗；組間對比采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）；兩兩組間對比采用SNK（Student-Newman-Keuls）法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型建立結(jié)果

建立小鼠牙移動模型后小鼠健康狀況良好。上頜左側(cè)第一磨牙加力后，輔軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)以確保實驗小鼠度過適應(yīng)期，加力組初戴裝置2 d內(nèi)體重略有降低，隨后正常飼養(yǎng)自由進食恢復(fù)常規(guī)水平。A組實驗組小鼠加力過程中死亡1只，B、C組小鼠實驗過程中無死亡，最終分別獲得9、10、10個動物標本。

2.2 MicroCT結(jié)果

MicroCT檢測結(jié)果如圖2所示，磨牙移動距離平均值：A組0.09 mm，B組0 mm，C組0 mm。其中A組與B、C組組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 HE染色觀察結(jié)果

各組牙周膜組織HE染色結(jié)果（圖3）示，B、C兩組牙根張力側(cè)與壓力側(cè)的牙周膜間隙均等，牙根兩側(cè)細胞無明顯差異；A組牙根張力側(cè)與壓力側(cè)的牙周膜間隙不均等，牙根兩側(cè)細胞有差異，壓力側(cè)細胞受到擠壓，張力側(cè)細胞受到拉伸。

圖2 MicroCT檢測第一磨牙移動情況 × 400Fig 2 MicroCT images of the first molars × 400

圖3 第一磨牙張壓力側(cè)牙周膜組織形態(tài)觀察 HE染色 × 200Fig 3 Morphology of periodontal tissues of the first molars HE staining × 200

2.4 TRAP染色結(jié)果

TRAP染色觀察結(jié)果如圖4所示，其中破骨細胞呈酒紅色陽性顆粒。B、C組中未見到TRAP染色陽性細胞，A組第一磨牙牙根近中側(cè)見到陽性破骨細胞。如圖5所示，A組組內(nèi)壓力側(cè)破骨細胞均數(shù)大于張力側(cè)，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B、C組組內(nèi)近遠中側(cè)無明顯差異，組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 PCR結(jié)果

如圖6所示，A組牙周組織OPG mRNA表達顯著降低，RANKL、Atg5、Atg7及Beclin-1 mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。B、C組牙周組織OPG、RANKL、Atg5、Atg7及Beclin-1 mRNA表達無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 第一磨牙張壓力側(cè)破骨細胞觀察 TRAP染色 × 200Fig 4 Osteoclasts observation of the first molars TRAP staining × 200

圖5 第一磨牙張壓力側(cè)TRAP染色陽性破骨細胞計數(shù)Fig 5 TRAP-positive osteoclasts number of the first molars

3 討論

本研究利用C57B/6近交系小鼠正畸牙移動模型，發(fā)現(xiàn)牙移動過程中RANKL及自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7及Beclin-1 mRNA的表達增加，OPG mRNA的表達降低，這就提示自噬可能是通過影響破骨水平，從而參與了正畸牙移動的骨塑建過程。

正畸牙移動受到牙移動類型、加力力值和加力時間的影響，因此建立科學精確的牙移動模型是進行正畸牙移動研究的基礎(chǔ)。

圖6 第一磨牙牙周膜OPG、RANKL、Atg5、Atg7和Beclin-1的mRNA相對表達量Fig 6 Relative expression levels of OPG, RANKL, Atg5, Atg7 and Beclin-1 mRNA of the first molars

在以往對正畸牙移動調(diào)控機制的動物模型研究中57%的研究是采用大鼠模型[8]。大鼠模型的優(yōu)點是操作視野較好，但其雜合性質(zhì)的遺傳背景可能導(dǎo)致出現(xiàn)大鼠在相同加力措施下產(chǎn)生不同反應(yīng)的情況，從而影響實驗結(jié)果的精確性和可信度[8]。

本研究選用各等位基因位點具有完全相同純合基因型的C57B/6近交系小鼠建立正畸牙移動模型，盡可能排除個體遺傳差異對實驗結(jié)果可能造成的影響，以提高結(jié)論的準確性。此外，適宜的矯治力對產(chǎn)生足夠的生物學反應(yīng)至關(guān)重要[9]，一些學者[8,10]認為由于大鼠磨牙比人磨牙小50倍，大鼠正畸牙移動模型中合適的力值應(yīng)控制在0.2 N以內(nèi)，實驗加力周期至少為2周。Gonzales等[11]的研究發(fā)現(xiàn)與重力相比，0.098 N輕力、加力14 d可以在大鼠正畸牙移動模型中產(chǎn)生更多的牙齒移動和更少的牙根吸收。在近期小鼠正畸牙移動的研究[12-14]中，選擇加載的力值大多為0.098 N，加力時間為12 d。而Chung等[15]發(fā)現(xiàn)，加載0.098 N力值時，在牙移動的壓力側(cè)有牙根吸收現(xiàn)象；Fujimura等[13]的研究中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，并認為可能是力值過大導(dǎo)致牙根吸收。基于以上研究結(jié)果，本研究在實驗設(shè)計時選擇加力力值為0.04 N、加力至12 d，以產(chǎn)生生理性、不良反應(yīng)更小的牙移動。

本研究結(jié)果顯示，A組加力組第一磨牙較對照組發(fā)生了明顯的近中移動（P＜0.05）；加力組張力側(cè)與壓力側(cè)的牙周膜間隙不均等，牙根兩側(cè)細胞有差異，壓力側(cè)細胞受到擠壓，張力側(cè)細胞受到拉伸；加力組組內(nèi)壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量大于張力側(cè)（P＜0.05）；加力組牙周組織OPG mRNA表達顯著降低（P＜0.05），RANKL mRNA表達顯著增加（P＜0.05）。這些結(jié)果均提示本實驗中小鼠牙受力后發(fā)生移動，為進一步研究自噬相關(guān)基因在正畸牙移動骨塑建中的作用提供了基礎(chǔ)。

自噬作為一種細胞內(nèi)的基本降解機制，既能維持細胞生存也能介導(dǎo)細胞死亡[5]。研究[16-18]表明自噬可被多種刺激因素如機械力、營養(yǎng)饑餓等作用快速誘發(fā)，而正畸牙移動過程中牙周組織正是受到機械力和饑餓的雙重刺激。因此，近年來自噬在正畸牙移動過程中牙周軟、硬組織改建中的作用逐漸受到學者關(guān)注。Memmert等[19]通過體外實驗探討了靜態(tài)拉伸應(yīng)變（static tensile strain）對人牙周膜成纖維細胞自噬水平的影響，結(jié)果表明人牙周膜成纖維細胞對拉伸應(yīng)變有漸進性的自噬反應(yīng)，即高應(yīng)變可引起自噬潮（autophagic flux）升高、而低應(yīng)變對自噬體的形成無明顯影響，且兩種應(yīng)變強度都對自噬相關(guān)mRNA的表達有調(diào)節(jié)作用，但高應(yīng)變對其影響更大。此外，周云[20]通過體內(nèi)實驗表明，在正畸矯治力作用下壓力側(cè)的牙周膜內(nèi)血管被壓縮、數(shù)目減少，局部牙周膜細胞處于缺氧、營養(yǎng)缺乏的狀態(tài)，即為一種“饑餓環(huán)境”，并進一步通過體外饑餓誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)“饑餓環(huán)境”可引起人牙周膜成纖維細胞內(nèi)自噬水平升高，包括細胞胞漿中自噬體數(shù)目增多、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）表達增高等；并提出自噬水平的升高可能是受壓牙周組織改建過程中牙周膜成纖維細胞對矯治力作用的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，也是壓力側(cè)細胞減少的機制之一。

自噬相關(guān)基因的編碼蛋白在自噬的誘導(dǎo)、產(chǎn)生、成熟及再循環(huán)中起重要作用，是自噬發(fā)生的關(guān)鍵分子[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)正畸移動的牙周組織中自噬相關(guān)基因表達增加，包括Atg5、Atg7和Beclin-1，這一結(jié)果與Chen等[22]的動物實驗研究結(jié)果類似。Beclin-1的作用是在自噬體形成早期階段招募其他復(fù)合物進行自噬體成核，而Atg5和Atg7則在自噬體形成最后階段的自噬體膜延伸和融合中起作用[23]，這些基因表達增加表明本實驗正畸牙移動過程中出現(xiàn)自噬水平升高。

此外，以往研究表明缺氧條件下自噬參與了破骨細胞的生物學作用表達，可提供破骨細胞分化所需能量并可通過促進炎癥因子的釋放介導(dǎo)破骨細胞成熟和發(fā)揮功能[24-26]。呂佳嶺等[27]通過探究SD大鼠正畸牙移動壓力區(qū)牙周膜的形態(tài)學變化、破骨細胞數(shù)量，以及不同時間段內(nèi)牙周膜細胞內(nèi)Beclin-1與微管相關(guān)蛋白2輕鏈3（microtubuleassociated protein 2 light chain 3，LC3II）的表達情況，提出自噬可能通過介導(dǎo)牙周膜透明樣變發(fā)生和影響破骨細胞生物學作用而參與牙周膜改建的過程。破骨細胞核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κ B，RANK）/RANKL/OPG信號通路是破骨細胞分化及骨吸收活動中的關(guān)鍵通路[28]，近期研究[29-30]證實自噬可通過這一信號通路調(diào)節(jié)骨礦化和骨穩(wěn)態(tài)。RANKL與RANK結(jié)合后可引起破骨細胞的增殖分化并促進骨吸收，而OPG可與RANKL競爭結(jié)合RANK，抑制骨吸收從而發(fā)揮骨保護作用。因此，可以通過OPG、RANKL和RANK的表達水平來判斷骨吸收活動的強弱[31]。本研究中加力組骨塑建相關(guān)基因RANKL表達顯著增加而OPG表達顯著降低，提示加力組骨吸收活動增強。

綜上所述，本實驗通過C57B/6小鼠正畸牙移動模型發(fā)現(xiàn)正畸力作用下牙周組織自噬相關(guān)基因表達水平提高、破骨活動增強，提示自噬可能通過影響牙周組織中破骨水平參與了正畸牙移動骨塑建過程，提高自噬可能對提高骨塑建及加速牙移動有著重要的基礎(chǔ)及臨床意義。但本研究僅從基因?qū)用嫣接懥苏酪苿舆^程中自噬水平的改變，存在一定局限性，未來研究需要結(jié)合體內(nèi)外實驗，從基因、蛋白、自噬體等多層面來探討自噬在正畸牙移動骨塑建過程中作用的具體機制。