陳 鋒，孟慶海，賴新華，徐曉梅，林曉春，李慶德，鄭錦坤

（1.廣東省粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān)512026；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023）

痔復(fù)康顆粒為粵北人民醫(yī)院的特色醫(yī)院制劑（粵藥制字Z20071535），有20多年的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)，由黃芩、槐米、黃芪、當(dāng)歸、大黃、柴胡、升麻、甘草等藥材組方，具有清熱利濕、潤腸通便、消腫止痛、益氣生肌之功效，臨床用于治療痔核脫垂、肛門腫痛，以及便秘、便血等癥。方中黃芩為君藥，味苦，性寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎[1]的功效。黃芩苷為黃芩主要活性成分之一[2]，具有多種藥理作用，如消炎、解熱、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等作用[3－14]。2015年版《中國藥典（一部）》將黃芩苷作為黃芩的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定痔復(fù)康顆粒中黃芩苷含量，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器及Chem StationA.10.02色譜工作站，美國安捷倫公司；CPA225D型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.1 mg）；MICRO－17R型冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；Milli－Q Advavtage A10型超純水機(jī)（美國Millipore公司）；WH－2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試藥

痔復(fù)康顆粒（粵北人民醫(yī)院制劑室，批號分別為170609，171109，180702，180925）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110715－201821）；水為超純水，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain AQ－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，0～7 min時(shí)5%A，7～17 min時(shí)15%A，17～22 min時(shí)27%A，22～30 min時(shí)32%A，30～36 min時(shí)70%A。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇溶解并定容，配制成黃芩苷質(zhì)量濃度為320μg／mL的對照品溶液。依次進(jìn)行倍比稀釋，配成7個(gè)不同質(zhì)量濃度（320，160，80，40，20，10，5μg／mL）的系列對照品溶液。

供試品溶液：取樣品顆粒，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為140 W，頻率為42 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按樣品處方比例，稱取缺黃芩的其余藥材，并按生產(chǎn)工藝制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺黃芩的陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取上述溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對照無干擾，表明專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下系列對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷的回歸方程Y＝12.785 X＋22.096（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在5～320μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取黃芩苷對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.79%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為170609）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.26%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為170609）樣品，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷含量的RSD為1.10%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（0.894 mg／g）的同一批（批號為170609）樣品0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，精密加入對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

樣品(批號分別為170609，171109，180702，180925)，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。結(jié)果4批樣品中黃芩苷含量分別為0.894，0.725，0.888，0.831 mg／g，平均含量為0.834 5 mg／g。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

取黃芩苷對照品溶液，在200～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長為254 nm，且在254 nm波長處得到的峰形、峰高最適宜，故選擇254 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相選擇

本研究中考察乙腈－甲酸水溶液、甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸水溶液、甲醇－甲酸水溶液、乙腈－磷酸水溶液等洗脫體系。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，乙腈－0.1%甲酸水溶液的分離效果較佳，故選擇其作為洗脫體系，并優(yōu)化得到最佳洗脫程序，黃芩苷的保留時(shí)間為24.4 min。

3.3 提取溶劑和提取時(shí)間確定

本研究中比較了甲醇溶液（100%，50%，10%，含5%濃氨試液）及乙醇溶液（100%，50%，10%，含5%濃氨試液）提取的效果，結(jié)果以50%甲醇溶液提取時(shí)效果最好，待測成分提取率相對較高。本研究中還考察了超聲提取時(shí)間為30，60，90 min時(shí)待測成分含量隨時(shí)間的變化情況，在60，90 min時(shí)，成分含量未見明顯變化，故確定超聲時(shí)間為60 min。

3.4 方法評價(jià)

本研究中建立的HPLC法高效、準(zhǔn)確、可靠，選擇的指標(biāo)成分貼近該制劑的主要藥味及功能主治，可為完善痔復(fù)康顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。