肖何芳

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九醫(yī)院，福建 福州350000）

抗炎退熱片收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，由蒲公英、黃芩2味中藥按1∶1加工制備而成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)功效，用于治療肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、瘡癰疔癤、紅腫熱痛諸癥[1]。方中蒲公英為菊科植物 蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.－Mazz.、堿地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，屬藥食同源中藥材，有抑菌抗炎、利膽保肝、通乳、健脾等藥理作用，常用于治療慢性咽喉炎、乳腺炎、尿路感染等疾病，含有酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、香豆素類(lèi)等多種有效成分，常以綠原酸、咖啡酸及菊苣酸等酚酸類(lèi)成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[2－4]。黃芩來(lái)源于唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類(lèi)成分是其重要活性成分。具有瀉火解毒、清熱燥濕、涼血止血、安胎利尿功效[5－6]。目前，多家企業(yè)生產(chǎn)的抗炎退熱片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃芩中的指標(biāo)成分黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，難以全面反映該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)作為多組分復(fù)雜樣品的質(zhì)量控制方法，具有整體性和模糊性特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)樣品內(nèi)在化學(xué)成分的整體質(zhì)量和綜合評(píng)價(jià)的全面控制[7－8]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜技術(shù)構(gòu)建了抗炎退熱片的指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定了綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素7種成分的含量，并結(jié)合聚類(lèi)分析對(duì)其含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行綜合分析，旨在多角度、多技術(shù)、更全面地控制抗炎退熱片的質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，包括2695四元梯度泵，2695自動(dòng)進(jìn)樣器，2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，Empower3色譜工作站(美國(guó)沃特世公司）；AUW－220D型電子天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753－201817，純度為96.8%），咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)為110885－201703，純度為99.7%），菊苣酸對(duì)照品（批號(hào)為111752－201703，純度為97.6%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715－201821，純度為95.4%），漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為112002－201702，純度為98.5%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595－201808，純度為97.9%），漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111514－201706，純度為100.0%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，批號(hào)為AS192217)，甲醇（色譜純，批號(hào)為MS1923814)，均購(gòu)自德國(guó)Merck公司；磷酸（分析純，批號(hào)為20181117，西隴科學(xué)股份有限公司）；試驗(yàn)用水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；抗炎退熱片[天津美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)分別為20180123（S1），20180219（S2），20180317（S3），20180421（S4），20180519（S5），20180614（S6），20180908（S7），20181015（S8），20181103（S9），171027（S10），171205（S11），規(guī)格為每片0.25 g]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[9－12]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)8%A，10～22 min時(shí)8%A→35%A，22～30 min時(shí)35%A→48%A，30～45 min時(shí)48%A→88%A，45～60min時(shí)88%A→8%A)；流速：0.85mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm（0～30 min，綠原酸、咖啡酸、菊苣酸），280 nm（30～60 min，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，7種成分間的分離度均大于1.5，拖尾因子均小于1.29，理論板數(shù)按綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰計(jì)均大于8 600。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用50%甲醇溶解，超聲處理，制成質(zhì)量濃度分別為1.689 5，3.645 3，3.202 9，5.916 3，4.010 7，3.182 6，1.701 4 mg／mL的混合對(duì)照品貯備液。

供試品溶液：取樣品20片，除去糖衣，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色容量瓶中，加入35 mL 50%甲醇溶液，室溫超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）40 min后取出，放冷至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。室溫避光保存。

2.3 HPLC方法學(xué)考察及指紋圖譜建立

精密度試驗(yàn)：取樣品[批號(hào)為20181015（S8）]，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，記錄色譜圖，以黃芩苷為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.77%和0.24%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品[批號(hào)為20181015（S8）]，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，5，10，15，20，24 h時(shí)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以黃芩苷為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為1.08%和0.43%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品[批號(hào)為20181015（S8）]，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以黃芩苷為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為1.05%和0.55%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

指紋圖譜的建立及相似度分析：取樣品（S1～S11），依法分別制備11批供試品溶液，按擬訂色譜條件對(duì)11批樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，記錄色譜數(shù)據(jù)，將11批樣品的色譜數(shù)據(jù)的AIA文件導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）軟件進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1。1～11號(hào)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.997，0.965，0.996，0.949，0.975，0.961，0.929，0.998，0.939，0.957，0.981，均大于0.92，質(zhì)量穩(wěn)定，符合指紋圖譜相關(guān)要求。

共有峰指認(rèn)：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）軟件對(duì)11批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較和分析。結(jié)果11批樣品共有19個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品溶液圖譜保留時(shí)間和紫外光譜圖對(duì)照，指認(rèn)出2號(hào)峰為綠原酸，3號(hào)峰為咖啡酸，5號(hào)峰為菊苣酸，12號(hào)峰為黃芩苷，14號(hào)峰為漢黃芩苷，17號(hào)峰為漢黃芩素，18號(hào)為黃芩素。在共有峰中，以12號(hào)峰的面積最大且峰位居中，分離完全，穩(wěn)定性較好，設(shè)為參照峰（S），計(jì)算其他共有峰對(duì)11號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及其RSD。詳見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜指紋圖譜及色譜圖

2.4 多指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.4.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置100 mL容量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，制得系列對(duì)照品溶液，室溫避光保存，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)，詳見(jiàn)表2。結(jié)果表明，7種成分質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。分別取峰面積信噪比（S／N）＝10和S／N＝3時(shí)的混合對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度考察定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 11批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

表2 7種指標(biāo)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果及定量限和檢測(cè)限（n＝6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液10μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢 黃 芩 素 峰 面 積 的RSD分 別 為0.44%，0.56%，0.67%，0.51%，0.72%，0.64%，0.69%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品(批號(hào)為20181015)，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，20，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的RSD分別為0.61%，0.74%，0.81%，0.52%，0.90%，0.65%，0.73%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20181015）樣品，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算7種成分的含量及其RSD。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量分別為0.936 1，1.883 4，1.669 5，3.811 7，2.200 6，1.673 2，0.860 2 mg／g，RSD分別為0.78%，0.89%，1.05%，0.75%，0.91%，0.95%，1.02%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20181015）樣品6份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，分別置50 mL棕色容量瓶中并精密加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.3 mL，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗炎退熱片7種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4.2 樣品含量測(cè)定

取S1～S11號(hào)樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。11批樣品中，綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量分別為0.930 1～0.938 8 mg／g，1.878 6～1.887 2 mg／g，1.661 4～1.673 9 mg／g，3.807 6～3.815 8 mg／g，2.196 9～2.206 1 mg／g，1.668 2～1.679 9 mg／g，0.855 9～0.865 8 mg／g。

2.5 聚類(lèi)分析

根據(jù)系統(tǒng)聚類(lèi)分析（CA）分到同一類(lèi)的樣品具有很大的相似性，而不同類(lèi)間的樣品會(huì)有相異性[13－14]。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用組間均聯(lián)法，以歐氏距離平方為測(cè)度，采用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法進(jìn)行模式識(shí)別分析。聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，類(lèi)間距離為15～25時(shí)，11批樣品被分成兩大類(lèi)：樣品S2，S7，S6，S10，S11，S4，S9，S5為一類(lèi)，與對(duì)照指紋圖譜相似度在0.929～0.981之間；樣品S1，S8，S3為一類(lèi)，相似度與對(duì)照指紋圖譜大于0.995。聚類(lèi)分析結(jié)果與相似度結(jié)果基本一致。這可能是由于藥材原材料質(zhì)量、產(chǎn)地及生產(chǎn)工藝等存在差異所致。

2.6 含量測(cè)定結(jié)果分析

將11批樣品中7種成分的含量測(cè)定結(jié)果輸入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的“描述性分析”，結(jié)果見(jiàn)表5及圖3?？梢?jiàn)，7種成分含量標(biāo)準(zhǔn)差值與平均值無(wú)明顯差異，即11批樣品中7種成分含量無(wú)異常值，表明樣品抗炎退熱片產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定。

3 討論

為實(shí)現(xiàn)綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的同時(shí)測(cè)定，本研究中采用DAD在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，為使各成分均在其最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，采用在不同時(shí)段切換不同檢測(cè)波長(zhǎng)的方法，即0～30 min檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm，檢測(cè)綠原酸、咖啡酸及菊苣酸；30～60 min檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，檢測(cè)黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素。考察流動(dòng)相時(shí)，選用了乙腈－水系統(tǒng)、甲醇－水系統(tǒng)、乙腈－磷酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定比例的酸有助于改善峰形；也比較了乙腈－磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）溶液、甲醇－磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）溶液進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，以乙腈－0.5%磷酸鹽水溶液為流動(dòng)相可得到HPLC色譜圖峰數(shù)量最多且分離度好。曾比較不同提取溶劑（甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇）、提取方式（浸漬過(guò)夜、加熱回流、超聲提?。?、提取時(shí)間（40，35，30 min）的效果，結(jié)果以50%甲醇溶液超聲提取40 min時(shí)，各待測(cè)成分提取率高。

表4 7種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）

圖2 11批抗炎退熱片聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

表5 抗炎退熱片中7種有效成分含量分析結(jié)果

圖3 抗炎退熱片中7種成分的含量范圍

本研究中建立的抗炎退熱片指紋圖譜，可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面綜合評(píng)價(jià)和分析；建立的HPLC法可同時(shí)測(cè)定抗炎退熱片中7種成分的含量，方法簡(jiǎn)單有效、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，可用于抗炎退熱片中綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的同時(shí)測(cè)定，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。