羅 群，楊思進(jìn)，蒲清榮，黃 銳，趙 劍，趙福蘭，王詩楊，王饒瓊，任 維，劉佳利

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州646000）

清肺排毒合劑處方源于國家中醫(yī)藥管理局和國家衛(wèi)生健康委員會聯(lián)合發(fā)文推薦全國各地治療新冠肺炎的清肺排毒湯，由漢代張仲景《傷寒雜病論》中的多個治療由寒邪引起外感熱病的經(jīng)典方劑化裁而來，包括小柴胡湯、麻杏石甘湯、射干麻黃湯、五苓散4個經(jīng)典方[1]。該制劑具有清肺排毒、宣降肺氣功效，用于治療邪熱蘊(yùn)肺，癥見發(fā)熱、咳嗽、咯痰、氣短、胸悶等，由麻黃、桂枝、黃芩、生石膏等21味中藥組方，在治療新型冠狀病毒肺炎（COVID－19）中顯示了獨(dú)特療效[2]。合劑能保存大量揮發(fā)性成分，工藝簡單，生產(chǎn)周期短，見效快，吸收好。本研究中通過顯色反應(yīng)對該制劑中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒別，通過薄層色譜（TLC）法對方中桂枝、麻黃、黃芩3味中藥進(jìn)行定性鑒別，通過高效液相色譜（HPLC）法測定該制劑中黃芩苷的含量，為清肺排毒合劑的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀，包括SPD－20A型紫外可見檢測器，LCsolution色譜工作站，AUW1200型電子天平(精度為十萬分之一)，購自日本島津公司；JPCT0328型超聲波提取器（武漢嘉鵬電子有限公司，功率為30～300 W，頻率為28 kHz）；JA203H型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司，精度為千分之一）；GOODLOOK－LOOK型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?；HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號為110715－201318，純度為93.3%），桂枝對照藥材（批號為121191－201304），鹽酸麻黃堿對照品（批號為171241－201508，純度為99.8%），黃芩對照藥材（批號為120955－201309），均購自中國食品藥品檢定研究院；1%香草醛濃硫酸溶液（實(shí)驗(yàn)室自制）；茚三酮試液(實(shí)驗(yàn)室自制，茚三酮購自成都市科龍化工試劑，批號為2013110901)；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 理化鑒別

揮發(fā)性成分：取樣品1瓶，置分液漏斗中，加乙醚25 mL，用少量乙醚洗滌瓶內(nèi)壁2次，洗液并入分液漏斗中，振搖提取，加入25 mL乙醚，取乙醚層，揮去乙醚，加新配置的1%香草醛濃硫酸溶液1～2滴，顯紫色。

2.2 TLC鑒別

桂枝：取樣品60 mL，用乙醚萃取2次，每次60 mL，合并乙醚萃取液，蒸干，加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取桂枝對照藥材0.25 g，加乙醇10 mL，密塞，超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液作為對照藥材溶液。按處方（除桂枝外）工藝與制法，制成陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。照TLC法2015年版《中國藥典（四部）》通則0502試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10～15μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（17∶3，V／V）為展開劑，展距約10 cm，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

麻黃：取樣品30 mL，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至8.0～9.0，用三氯甲烷振搖提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方（除麻黃外）工藝與制法，制成陰性對照品，按供試品溶液制備方法陰性對照品溶液。照TLC法2015年版《中國藥典（四部）》通則0502試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（20∶5∶0.5，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1B。

黃芩：取樣品30 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0～3.5，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次50 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮30 min（適時補(bǔ)充水），濾過，濾液自“用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0～3.5”起，同法制成對照藥材溶液。按處方（除黃芩外）工藝與制法，制成陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照TLC法2015年版《中國藥典（四部）》通則0502試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（5∶3∶1∶1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil Eternity XT－C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2，V／V／V）；流速：1 mL／min；檢測波長：280 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 500。

2.3.2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60μg的溶液，即得對照品溶液。精密量取本品2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。精密量取缺黃芩的陰性樣品溶液2.5 mL，依法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取2.3.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果樣品中黃芩苷色譜峰峰形良好，且陰性對照無明顯干擾。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取質(zhì)量濃度為855.93μg／mL的對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為6.85，171.19，342.37，513.56，684.75，855.93μg／mL的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷回歸方程Y＝32 245 X－288 027，r2＝0.999 4（n＝6）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在6.85～855.9μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為0.171 2 mg／mL的黃芩苷對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20200209）樣品6份，依法平行制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果的RSD為0.13%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，12，24 h時進(jìn)樣，測定其峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.98%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品1.25 mL，分別精密加入黃芩苷對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

耐用性試驗(yàn)：取樣品（批號為20200209），依法制備供試品溶液，改變擬訂色譜條件中的測定波長為（280±2）nm，柱溫為（40±5）℃，測定含量。結(jié)果見表2。可見，HPLC法測定黃芩苷時，波長、柱溫小的變動時耐用性合適，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，方法可靠。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20200224，20200225，20200226）樣品，依法制備供試品溶液，測得樣品中黃芩苷含量分別為1.10，1.14，1.18 mg／mL，平均1.14 mg／mL。

3 討論

3.1 定性鑒別藥材選擇

采用TLC法對清肺排毒合劑中的桂枝、麻黃、黃芩進(jìn)行定性鑒別，斑點(diǎn)分離清晰，陰性對照無干擾，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為清肺排毒合劑有效的定性鑒別方法。本研究中，對桂枝、麻黃、黃芩均建立了3種不同展開系統(tǒng)[3－5]，如桂枝薄層展開系統(tǒng)石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（17∶3，V／V）、石油醚（30～60℃）－乙酸乙酯（17∶3，V／V）、正己烷－乙醚－冰乙酸（5∶5∶0.1，V／V／V）；麻黃薄層展開系統(tǒng)三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（20∶5∶0.5，V／V／V）、乙醇－濃氨試液（10∶0.5，V／V）、三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（20∶3.5∶0.5，V／V／V）；黃芩薄層展開系統(tǒng)乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（5∶3∶1∶1，V／V／V／V）、乙酸乙酯－甲醇－甲酸－水（8∶1∶1∶1，V／V／V／V）、乙酸乙酯－甲酸－水（8∶1∶1，V／V／V），斑點(diǎn)均較清晰，易于區(qū)分，驗(yàn)證了TLC鑒別的可靠性，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

曾考察白術(shù)、甘草、陳皮、澤瀉、款冬、紫菀的TLC，其中白術(shù)、甘草、陳皮陰性有干擾，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；澤瀉、款冬、紫菀未檢出相應(yīng)斑點(diǎn)，未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。考慮澤瀉主要藥用成分23－乙酰澤瀉醇B（脂溶性成分）水溶性較差，而該合劑制備工藝中提取溶劑為水，會導(dǎo)致其提取率較低；另外，23－乙酰澤瀉醇B穩(wěn)定性差，遇熱易轉(zhuǎn)化成澤瀉醇B和24－乙酰澤瀉醇A，最終轉(zhuǎn)化成澤瀉醇A[6]。款冬的主要成分款冬酮、紫菀的主要成分紫菀酮均為脂溶性成分，用水煎煮提取率較低，紫菀酮水溶性較差，在水中易析出，離心除雜或醇沉除雜可將大部分紫菀酮除去（損失80%以上）[7]。

3.2 含量測定成分選擇

清肺排毒合劑中主要藥味黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，含有黃酮類、萜類、酚酸類、苯乙醇、氨基酸、甾醇、揮發(fā)油、多糖、微量元素等多種化學(xué)成分[8]。其中，含量較高的黃酮類成分黃芩苷是黃芩發(fā)揮功效的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、清除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管及神經(jīng)元、保肝、降糖調(diào)脂、抗抑郁等藥理作用[9]。黃芩苷能抑制病毒復(fù)制、保護(hù)宿主，發(fā)揮抗病毒作用；可明顯延長流感病毒感染小鼠的存活時間，對小鼠肺內(nèi)的流感病毒有一定清除作用，能降低肺內(nèi)流感病毒的血凝滴度和感染力，減輕小鼠肺內(nèi)的炎性病變[10－11]。試驗(yàn)證明，黃芩苷有抗肺炎衣原體和保護(hù)細(xì)胞作用[12]；同時，可抑制中樞發(fā)熱介質(zhì)前列腺素E2（PGE2）和cAMP的生成發(fā)揮解熱作用，抑制白細(xì)胞內(nèi)白三烯C4、白三烯B4的生物合成及fMLP激發(fā)的白細(xì)胞內(nèi)Ca2＋升高，發(fā)揮抗炎作用[13－14]。綜合考慮，選擇黃芩苷作為清肺排毒合劑含量測定控制指標(biāo)。

3.3 色譜條件選擇

含量測定項(xiàng)下以黃芩苷為指標(biāo)，直接量取清肺排毒合劑，用純化水稀釋制備供試品溶液，方法簡單、快捷、環(huán)保、準(zhǔn)確[3，15]；在選擇流動相時，參考2015年版《中國藥典（一部）》黃芩含量測定項(xiàng)下的色譜條件，采用甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2，V／V／V）作為流動相。結(jié)果，黃芩苷分離度好，雜質(zhì)峰無干擾，峰形良好。

3.4 方法評價

根據(jù)3批清肺排毒合劑的指標(biāo)含量測定結(jié)果，考慮飲片的差異性、生產(chǎn)過程中的波動因素及制劑的穩(wěn)定性，將樣品中指標(biāo)含量的平均值下調(diào)20%，初步擬訂清肺排毒合劑中黃芩苷的含量不低于0.9 mg／mL。