王 瑩，李耀磊，岳洪水，劉麗娜，金紅宇 ，馬雙成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京100025；2.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津300402）

注射用益氣復(fù)脈（凍干，YQFM）處方來源于古方生脈散，由紅參、麥冬、五味子組方，以甘露醇和葡甲胺為輔料，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津功效[1]，臨床主要用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病心絞痛和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病慢性心力衰竭等[2]。YQFM于2007年批準(zhǔn)上市，現(xiàn)行法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ07062006－2009Z－2015，主要對(duì)其皂苷類、木脂素類及糖類成分進(jìn)行控制。YQFM主要化學(xué)成分包括三萜皂苷、甾體皂苷、木脂素、糖等[3－6]，其中對(duì)皂苷類成分的研究較深入，對(duì)單糖及雙糖成分的研究則較少。糖類成分作為主要質(zhì)控指標(biāo)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用苯酚硫酸－紫外分光光度法對(duì)總糖進(jìn)行測(cè)定，但缺乏專屬性，無法獲取糖的種類信息，且操作步驟復(fù)雜，重復(fù)性不佳。故本研究中擬對(duì)YQFM中糖類成分的測(cè)定方法進(jìn)行研究。目前，糖組成測(cè)定方法包括薄層色譜（TLC）法、氣相色譜（GC）法、高效液相色譜（HPLC）法等。TLC法具有簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，常作為糖類鑒別方法[7－9]。由于糖極性大、難氣化，故使用GC分析前需對(duì)糖進(jìn)行硅烷化或酯化等處理；由于糖無紫外吸收，若采用HPLC－UV檢測(cè)器分析，需先對(duì)其進(jìn)行衍生化，操作較煩瑣；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，在對(duì)無紫外吸收化合物進(jìn)行分析時(shí)具有基線穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于糖類物質(zhì)尤其是單糖和雙糖的檢測(cè)[10－11]。電噴霧檢測(cè)器（CAD）是一種通用型檢測(cè)器，其檢測(cè)信號(hào)不依賴于被檢測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能檢測(cè)大部分非揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)，作為通用型檢測(cè)器目前已有報(bào)道將其應(yīng)用于單糖和寡糖的檢測(cè)[12－13]。本研究中分別采用TLC法和HPLC－CAD法對(duì)YQFM中糖的種類和含量進(jìn)行測(cè)定，以期為YQFM的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000型液相色譜儀，配置CAD檢測(cè)器（美國賽默飛世爾科技公司）；TLC點(diǎn)樣系統(tǒng)，TLC薄層顯像系統(tǒng)，均購自瑞士卡瑪公司。

1.2 試藥

果糖對(duì)照品（批號(hào)為100231－201807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%），D－無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為110833－201707，含量為99.9%），蔗糖對(duì)照品（批號(hào)為111507－201303，含量為99.8%），麥芽糖對(duì)照品（批號(hào)為100287－201303，含量為94.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；TLC硅膠G薄層板（Merck公司）；注射用益氣復(fù)脈（凍干，天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，編號(hào)分別為S1～S5，規(guī)格為每瓶0.65 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法鑒別糖組成

溶液制備：分別取葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖，制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的單標(biāo)溶液。分別吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得混標(biāo)溶液。精密稱取樣品100 mg，置10 mL容量瓶中，加水制成質(zhì)量濃度為10 mg／mL的溶液，搖勻，即得供試品溶液。

薄層展開條件：取對(duì)照品溶液及供試品溶液，在薄層板上各點(diǎn)樣2μL，展開劑為正丁醇－異丙醇－水－醋酸（7∶5∶2∶1，V／V／V／V），展開，取出，吹干，苯胺－二苯胺顯色劑顯色，置加熱板（105℃，加熱10 min），在日光下觀察。

樣品測(cè)定：采用上述方法對(duì)5批樣品進(jìn)行TLC檢測(cè)，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相對(duì)應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn)。由圖1可見，5批樣品均包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖，其中果糖、葡萄糖、蔗糖主斑點(diǎn)顯色明顯，蔗糖斑點(diǎn)顯色略弱于其他3種單糖，顯示可能蔗糖含量較低。

2.2 HPLC－CAD法分析糖組成

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P－50柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：水（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min，10%A→40%A）；流速：0.8 mL／min；柱溫：30℃；CAD霧化溫度：45℃；進(jìn)樣量：10μL；PF值：1.3。在此色譜條件下的色譜圖見圖2。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜－電噴霧檢測(cè)器色譜圖

2.2.2 溶液制備

分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品適量，制成質(zhì)量濃度為0.60，0.20，0.20，0.20 mg／mL的混合對(duì)照品溶液。精密稱取120 mg的樣品，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定各成分的峰面積，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n＝5)

精密度試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定各成分的峰面積。結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為3.26%，1.60%，1.41%，1.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號(hào)為S1）60 mg，精密稱定，共6份，分別按樣品－對(duì)照品1∶1的比例加入對(duì)照品，依法制備供試品溶液，搖勻，按擬訂色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品適量，依法平行制備供試品溶液6份，并測(cè)定其果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，計(jì)算RSD值。結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的RSD分別為1.67%，2.50%，3.22%，1.35%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）適量，依法制備供試品溶液，分別于0，5，10，15，20，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定各成分的峰面積。結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為4.84%，3.97%，3.96%，2.37%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取5批樣品(批號(hào)分別為S1～S5)，各2份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算4種糖的含量。結(jié)果見表3。5批樣品中4種糖的平均質(zhì)量比為3.4∶1.0∶1.1∶0.7，糖總量為16.05%～17.68%，均符合現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 5批樣品中4種糖含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

3.1 TLC條件優(yōu)化

對(duì)TLC展開系統(tǒng)及顯色劑進(jìn)行考察，分別采用正丁醇－異丙醇－水－醋酸為展開溶劑，苯胺－二苯胺為顯色劑；正丁醇－0.1 mol／L磷酸氫二鈉－丙酮為展開劑，α－萘酚試液為顯色劑；正丁醇－醋酸乙酯－異丙醇－乙酸－吡啶－水為展開劑，苯胺－鄰苯二甲酸溶液為顯色劑。結(jié)果表明，正丁醇－異丙醇－水－醋酸的分離效果最佳，故以此為展開條件。

前期研究中采用確定的TLC條件，對(duì)9種單糖（葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖）、雙糖及樣品進(jìn)行測(cè)定及鑒別，發(fā)現(xiàn)YQFM中主要由4種糖類成分組成，即果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖。文獻(xiàn)[14]顯示，YQFM中紅參的主要糖成分為蔗糖和麥芽糖，麥冬中主要糖成分為果糖和葡萄糖，故上述4個(gè)單糖可作為YQFM中反映藥味質(zhì)量的有效指標(biāo)。

3.2 HPLC－CAD條件優(yōu)化

曾考察流動(dòng)相梯度洗脫和等度洗脫，結(jié)果梯度洗脫時(shí)分離效果好，最終確定流動(dòng)相為乙腈－水、梯度洗脫。

3.3 CAD法與紫外可見分光光度法測(cè)定結(jié)果比較

采用HPLC－CAD法及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的苯酚硫酸法對(duì)3批樣品中糖含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)2種方法存在一定差異，紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果均顯著高于CAD法的測(cè)定結(jié)果，這可能與苯酚硫酸法顯色原理有關(guān)。不同單糖顯色程度有差異，以葡萄糖作為對(duì)照品計(jì)算可能導(dǎo)致結(jié)果存在誤差[15]。由總糖含量測(cè)定結(jié)果可知，2種方法的測(cè)定結(jié)果均符合現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)（總糖含量限度為每瓶不得少于0.10 g）。

3.4 方法評(píng)價(jià)

采用TLC結(jié)合HPLC－CAD法對(duì)益氣復(fù)脈中糖類成分組成及其含量進(jìn)行分析，該方法相較于原標(biāo)準(zhǔn)中的苯酚硫酸－紫外分光光度法，專屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速，成本低，可用于生產(chǎn)過程及成品制劑的質(zhì)量控制。