陳永順，吳 珍

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰442000）

右旋酮洛芬氨丁三醇（DKT）是具有苯丙酸結(jié)構(gòu)的非甾體抗炎藥，有抗炎、抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛的藥理活性[1]，半衰期較短，維持有效血藥濃度時(shí)間有限，對胃腸道刺激性較大。水凝膠貼劑具有無刺激性、載藥量大、透皮效果好、生物利用度高及透氣性好等優(yōu)點(diǎn)[2]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到藥品的研發(fā)及生產(chǎn)。將DKT制成水凝膠貼劑，既可發(fā)揮長效鎮(zhèn)痛作用，又能減少胃腸道的不良反應(yīng)。本研究中制備了DKT水凝膠貼劑[3]，并以DKT灌胃給藥組為參比，用高效液相色譜（HPLC）法測定其血藥濃度，考察DKT水凝膠貼劑在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，計(jì)算其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，為其開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為0.000 1 g）；TGL－16BG型臺式高速離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；SK－1型快速混勻器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；氮?dú)獯蹈蓛x（上海鄆曹電子科技有限公司）。

試藥：DKT水凝膠貼劑（自制，批號為20190615，每貼100 mg）；DKT對照品（批號為101296－201401，純度為99.36%），萘普生鈉對照品（批號為100330－200702），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，批號為20190416），乙腈（色譜純，批號為20190125），均購自Fisher公司；其他試劑均為分析純。

動(dòng)物：比格犬，6只，雌雄各半，體質(zhì)量（15±0.2）kg，湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號為SCYY（鄂）2019－0011。所有動(dòng)物試驗(yàn)的操作規(guī)程和協(xié)議均按照湖北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)頒布的試驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)指導(dǎo)守則進(jìn)行。每天供給比格犬統(tǒng)一的飼料和水，飼養(yǎng)溫度控制在室溫(20～24℃)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[4]

色譜柱：Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：5 mol／L磷酸鹽緩沖溶液－乙腈（73∶27，V／V）；檢測波長：260 nm；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取DKT對照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000μg／mL的DKT對照品貯備液。用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100，50，10，5，2.5，1.25，0.625μg／mL的系列對照品溶液，置4℃下保存，備用。

內(nèi)標(biāo)溶液：取萘普生鈉對照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000μg／mL的萘普生鈉對照品貯備液。用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為250μg／mL的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃下保存，備用。

2.3 血漿樣品處理[5－6]

取比格犬血漿200μL置離心管中，加入10μL萘普生鈉內(nèi)標(biāo)溶液（250μg／mL），振蕩，混勻。加入0.1 mL鹽酸（0.1 mol／L），渦旋混勻1 min，加入乙醚3 mL，渦旋混合3 min。吸取上清液2 mL，置離心管中，40℃氮?dú)鈨x吹干。殘?jiān)尤?00μL甲醇溶解，渦旋混合1.0 min，12 000 r／min離心5 min，取上清液0.22μm，濾膜濾過，取20μL進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取比格犬空白血漿，加有DKT和內(nèi)標(biāo)萘普生鈉對照品溶液的空白血漿，作為樣品血漿，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。可見，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DKT及內(nèi)標(biāo)萘普生鈉的測定，DKT、萘普生鈉的保留時(shí)間分別為10.45 min和8.23 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取空白血漿200μL，上述對照品系列溶液20μL，配成10，5，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。以DKT的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)，DKT與萘普生鈉的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝17 862 X－2 438.6，r＝0.998 2(n＝7)。結(jié)果DKT質(zhì)量濃度在0.062 5～10.0μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別取空白血漿200μL 15份，加入不同質(zhì)量濃度的DKT對照品溶液，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5，0.5，0.125μg／mL）的血漿樣品，混勻，按2.3項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度配制3份，連續(xù)測定3 d，日內(nèi)及日間各重復(fù)5次。結(jié)果表明儀器精密度良好，詳見表1。

表1 血漿中DKT提取回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

提取回收試驗(yàn)：分別取比格犬空白血漿200μL 15份，加入不同質(zhì)量濃度的DKT對照品溶液，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5，0.5，0.125μg／mL）的血漿樣品。按2.3項(xiàng)下方法處理，取20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣得DKT峰面積(A1)。取DKT等濃度標(biāo)準(zhǔn)液直接進(jìn)樣所得峰為A2。依“(A1／A2)×100%”計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取空白血漿200μL 15份，加入不同質(zhì)量濃度的DKT對照品溶液，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5，0.5，0.125μg／mL）的血漿樣品，分別于室溫放置24 h、－20℃冰箱保存24 h和凍融循環(huán)（－20℃）3次后，分別按2.3項(xiàng)下方法處理。考察血漿樣品在上述3種條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果的RSD均小于4.92%（n＝5），表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 給藥方案與血樣采集[7－9]

取健康比格犬6只，隨機(jī)分為A組和B組，每組3只。A組灌胃給藥，給藥劑量為0.5 mg／kg，B組比格犬給予DKT水凝膠貼劑，給藥劑量為1貼（規(guī)格為每貼100 mg），給藥前2 d于犬左上腹部毛，飼養(yǎng)待用，腹部剃毛區(qū)緊密貼敷DKT水凝膠貼劑，給犬穿上棉質(zhì)背心以防貼劑被其撕落。給藥前12 h禁食不禁飲。分別于給藥前和給藥后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24 h時(shí)從犬前肢內(nèi)側(cè)下靜脈取血2 mL。按2.3項(xiàng)下方法處理，按擬訂方法測定血藥濃度，并繪血藥濃度－時(shí)間(C－t)曲線圖，詳見圖2。可見，灌胃給藥組的達(dá)峰時(shí)間短且代謝迅速，DKT水凝膠貼劑的達(dá)峰時(shí)間延長，且能較長時(shí)間內(nèi)維持較高血藥濃度，具有緩釋給藥特征。

圖2 右旋酮洛芬氨丁三醇在比格犬體內(nèi)平均血藥濃度－時(shí)間曲線圖（X±s，n＝3）

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定[10]

采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件對血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對兩組給藥方式的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DKT在比格犬灌胃給藥和水凝膠貼劑給藥后的平均藥－時(shí)曲線均符合二室模型。與灌胃給藥組相比，DKT水凝膠貼劑達(dá)峰時(shí)間（tmax）、分布相半衰期（t1／2α）、消除相半衰期（t1／2β）及0～24 h平均駐留時(shí)間（MRT0→24h）均顯著延長或升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 比格犬給藥后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（X±s，n＝3）

3 討論

參考文獻(xiàn)[8]，采用HPLC法測定血漿中DKT的濃度，并以萘普生鈉作為內(nèi)標(biāo)，DKT與內(nèi)標(biāo)萘普生鈉的峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DKT及內(nèi)標(biāo)萘普生鈉的測定，DKT和萘普生鈉的保留時(shí)間分別為10.15 min和8.23 min，表明該方法可用于實(shí)驗(yàn)室條件DKT水凝膠貼劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

DKT普通制劑半衰期較短，需頻繁給藥，且具有較強(qiáng)的抗炎、抗風(fēng)濕和鎮(zhèn)痛的藥理活性，為其開發(fā)成貼劑劑型提供了有利條件。在DKT灌胃給藥的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)中，tmax為0.5 h，t1／2α為0.29 h，t1／2β為3.01 h，表明DKT普通制劑在體內(nèi)吸收代謝非常迅速，難以維持較長時(shí)間的有效血藥濃度。而在DKT以水凝膠貼劑給藥，tmax為6.02 h，t1／2α為1.86 h，t1／2β為10.11 h，顯著延長了DKT在比格犬體內(nèi)的作用時(shí)間，并能較長時(shí)間維持較高血藥濃度。

給藥劑量的設(shè)計(jì)主要考慮DKT對胃腸道的刺激性及水凝膠貼劑的完整性。DKT灌胃給藥組給藥劑量參考成人服用該藥的常規(guī)劑量（每次25 mg），按成人體質(zhì)量平均折算出比格犬給藥劑量，因此該組設(shè)計(jì)給藥劑量為0.5 mg／kg。而DKT水凝膠貼劑為釋放不完全制劑，與其他貼劑一樣，生物利用度低，同時(shí)考慮到水凝膠貼劑的完整性。因此，設(shè)計(jì)該組給藥劑量為1貼（每貼100 mg），為盡可能地減少實(shí)驗(yàn)誤差，盡量挑選質(zhì)量差異小的比格犬來參與實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)中對DKT水凝膠貼劑在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步研究，與灌胃給藥相比，DKT水凝膠貼劑顯著延長了DKT在比格犬體內(nèi)的作用時(shí)間，并能較長時(shí)間維持較高血藥濃度，具有緩釋給藥特征，可為DKT水凝膠貼劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。