陳亞梅，李冬水 ，余明主

（1.中國人民解放軍第908醫(yī)院，江西 南昌330002；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌330006）

近年來，去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）瘤內(nèi)從頭合成雄激素已成為研究熱點(diǎn)，采用阿比特龍治療CRPC患者可減弱腫瘤內(nèi)新生雄激素的作用[1]。膽固醇是雄激素從頭合成中的主要原料，且多種酶在此過程中起著重要作用。他汀類藥物是一種治療高脂血癥的藥物，通過抑制3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶來降低血清膽固醇水平[2]。其中，辛伐他汀可降低雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[3]。在體外，他汀類藥物可通過降低膽固醇含量來抑制直結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[4]；可通過抑制胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）的表達(dá)來抑制前列腺癌的進(jìn)展[5]。Ras／Rhodopsin（Rho）信號通路在細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性中起著不可替代的作用[6]。Ras在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3中下調(diào)，抑制腫瘤的發(fā)展[7]。7Rho信號通路是Ras同源基因家族成員之一，Rho相關(guān)卷曲螺旋形成激酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的形成，進(jìn)而參與副黏病毒感染，與多種惡性腫瘤相關(guān)[8]。本研究中探討了辛伐他汀對人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及Ras／Rho信號通路在此過程中的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Revco公司）；高速低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Thermo Scientific液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC－MS，美國Thermo Scientific公 司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司）；實時熒光定量PCR（美國Bio－Rad公司）。

試藥：辛伐他汀、多西紫杉醇、5－乙基－2′－脫氧尿嘧啶核苷（EDU，美國Sigma公司，批號分別為S6196，S1572，S3482）；前列腺癌PC3細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，批號為CM－125429）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號為160044）；RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號為190045）；細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（EDU，美國Invitrogen公司，批號為1574）；TdT介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號為CA1020）；TRIzol（天根生化科技有限公司，批號為DP421）；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司，批號為RR047A）；UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號為TK08045）；MicroRNA let－7（let－7）、神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同源物（NRAS）、Ras、Rho和U6引物（大連TaKaRa公司）。let－7上游引物為5′－CGGCTCGCATGAGGTAGTAGG－3′，下游引物為5′－CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA－3′；NRAS上游引物為5′－GCGAAGGCTTCCTCTGTGTA－3′，下游引物為5′－CCCGTAACTCTTGGCCAGTT－3′；Ras上游引物為5′－GGGAGGATTGTGGCCTTCTT－3′，下游引物為5′－TGTGCAGGTGCCGGTTCAG－3′；Rho上游引物為5′－ATCATGGGCTGGACATTGGA－3′，下游引物為5′－ACAGGGACATCAGTCGCTTCA－3′；U6引物序列：上游引物為5′－GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT－3′，下游引物為5′－CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT－3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含胎牛血清（10%）的RPMI－1640培養(yǎng)液在37℃及5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)PC3細(xì)胞，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。分為陰性對照組（A組），陽性對照組（B組），辛伐他汀低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組）。A組加入無血清RPMI－1640培養(yǎng)基，B組加入含有終濃度為4μmol／L的多西紫杉醇[9]，C1組、C2組、C3組分別加入終濃度為1.25，2.50，5.00μmol／L的辛伐他汀[10]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 EDU法測定PC3細(xì)胞增殖

將PC3細(xì)胞以5×103個／孔接種于96孔板中，每孔200μL，待細(xì)胞融合后，按1.2項下給予受試物干預(yù)48 h，換用50 mmol／L EDU溶液孵育4 h，4%甲醛固定15 min，0.5% Triton X－100處理20 min，以便在室溫下通透。將細(xì)胞在室溫下用100 mL Apollo染色30 min，再用100 mL Hoechst避光孵育30 min。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和攝像，并計算EDU摻入率[EDU摻入率＝EDU陽性細(xì)胞數(shù)（紅色染色的細(xì)胞）／C4－2細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色染色的細(xì)胞）]。

1.4 TUNEL法測定PC3細(xì)胞凋亡

將PC3細(xì)胞以5×104個／孔接種于6孔板內(nèi)，每孔3 mL，待細(xì)胞融合后，按1.2項下方法給予受試物干預(yù)48 h，棄培養(yǎng)基，4%甲醛固定15 min，依次用50%，75%，95%，100%乙醇脫水5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，0.5%Triton X－100處理20 min，加入TUNEL工作液，37℃孵育1 h，使用熒光顯微鏡檢測凋亡細(xì)胞（綠色熒光染色），碘化丙啶（PI）反染細(xì)胞核，計數(shù)綠色和紅色熒光細(xì)胞[計數(shù)陽性細(xì)胞率（%）＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)／藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)]。

1.5 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS／MS)法測定培養(yǎng)基中睪酮和二氫睪酮（DHT）的濃度

將PC3細(xì)胞以5×104個／孔接種于6孔板內(nèi)，每孔3 mL，待細(xì)胞融合后，按1.2項下方法給予受試物干預(yù)48 h，將雄烯二酮（100μmol／L）添加到培養(yǎng)基中，24 h后收集培養(yǎng)基，并使用LC－MS／MS測量睪酮和DHT濃度。

1.6 實時熒光定量PCR（RT－PCR）檢測let－7，NRAS，Ras和Rho m RNA水平

以5×104個／孔接種于6孔板內(nèi)，每孔3 mL，待細(xì)胞融合后，按1.2項下方法給予受試物干預(yù)48 h，使用TRIzol從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，用蛋白核酸檢測儀測定mRNA濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，制備20μL反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃30 s，變性95℃5 s，60℃45 s，38個循環(huán)。61℃時采集熒光，用實時熒光定量PCR儀檢測，對其表達(dá)量進(jìn)行分析，以U6作為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，用單因素方差分析進(jìn)行判斷，組間兩兩比較用SNK－q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與A組相比，B組、C1組、C2組、C3組EDU的摻入率降低，細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組相比，C1組、C2組、C3組的EDU摻入率增加，細(xì)胞凋亡率降低，隨著辛伐他汀劑量的增加，EDU摻入率逐漸降低，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。詳見表1和圖1。

表1 辛伐他汀對PC3細(xì)胞增殖和凋亡、PC3細(xì)胞中睪酮和DHT及l(fā)et－7，NRAS，Ras和Rho mRNA表達(dá)的影響（X±s）

圖1 辛伐他汀對PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 對PC3細(xì)胞中睪酮和DHT的影響

與A組相比，B組和C1組、C2組、C3組睪酮和DHT降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組相比，C2組和C3組睪酮和DHT增加，隨著辛伐他汀劑量的增加，睪酮和DHT逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 對PC3細(xì)胞中l(wèi)et－7，NRAS，Ras和Rho m RNA表達(dá)的影響

與A組相比，B組和C1組、C2組、C3組let－7增加，NRAS，Ras，Rho降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與B組相比，C2組和C3組let－7降低，NRAS，Ras，Rho增加，隨著辛伐他汀劑量的增加，let－7逐漸增加，NRAS，Ras，Rho增加降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

3 討論

他汀類藥物可用于預(yù)防癌癥或潛在的癌癥，且與總前列腺癌風(fēng)險間呈負(fù)相關(guān)[11]，與總體風(fēng)險無關(guān)，但與晚期前列腺癌風(fēng)險降低有關(guān)（尤其是轉(zhuǎn)移性或致命性前列腺癌風(fēng)險）[12]。他汀類藥物在體外具有多種抑制前列腺癌進(jìn)展的生物學(xué)活性，如降低膽固醇含量、抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶－2（CDK－2）活性、降低胰島素樣生長因子1(IGF1)表達(dá)、增加移植瘤細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白A10（ANXA10）表達(dá)，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡或阻止前列腺癌細(xì)胞的增殖，但其抗癌機(jī)制尚不清楚[13]。本研究中使用已知為侵襲性前列腺癌細(xì)胞的PC3細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明辛伐他汀有可能減緩高級別前列腺癌的發(fā)展，但療效不如多西紫杉醇。但考慮到多西紫杉醇的耐藥性和毒副作用，辛伐他汀依然是一種很有前景的替代藥物。

他汀類藥物可降低雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，而雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞不能調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體的表達(dá)[14]。從頭合成雄激素是CRPC的治療目標(biāo)。在雄激素合成途徑中，膽固醇是主要物質(zhì)[15]。本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀可降低睪酮和DHT水平。

Ras／Rho信號通路可介導(dǎo)抑制高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞；參與前列腺癌血管生成的過程，被阻斷的Ras／Rho信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和血管生成[16]。前列腺癌細(xì)胞中Ras／Rho信號通路的表達(dá)受雄激素調(diào)節(jié)。DHT和人工合成的雄激素（R1881）在雄激素受體陰性的PC3細(xì)胞中激活了Ras／Rho信號通路[17]。同時，R1881不會影響雄激素受體陽性的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中Ras／Rho信號通路的表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀可抑制PC3細(xì)胞中Ras和Rho表達(dá)。let－7在不同物種中均有表達(dá)，人類let－7表達(dá)的變化與多種癌癥相關(guān)。上調(diào)的let－7在體內(nèi)外均可抑制前列腺癌的克隆擴(kuò)增、腫瘤再生和細(xì)胞增殖[19]。let－7可能通過調(diào)節(jié)與自我更新和生長能力相關(guān)的癌基因的表達(dá)來抑制前列腺癌的形成[20]。Targetscan網(wǎng)站顯示，let－7和NRAS間存在特殊的結(jié)合區(qū)域。多數(shù)前列腺癌細(xì)胞攜帶突變的NRAS，NRAS突變可能成為前列腺癌監(jiān)測和治療的潛在生物標(biāo)志物[21]。let－7通過靶向與NRAS相似的基因，在不同的癌癥中發(fā)揮抑制作用。當(dāng)NRAS過表達(dá)時，會誘導(dǎo)癌細(xì)胞的持續(xù)增殖[22]。推測上調(diào)的let－7和下調(diào)的NRAS可能抑制CRPC的發(fā)展；與Ras／Rho信號通路相關(guān)的基因NRAS被let－7抑制，從而阻斷Ras／Rho信號通路，抑制其增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，辛伐他汀能抑制PC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與Ras／Rho信號通路激活有關(guān)。辛伐他汀可能是治療前列腺癌的有效策略，但其具體作用機(jī)制和臨床應(yīng)用仍需作進(jìn)一步研究。