胡清泉，鄧如非，張友來

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷中心，南昌330006)

創(chuàng)面修復(fù)是燒傷治療的永恒主題[1]。 機體對于熱力損傷最初反應(yīng)包括熱力直接導(dǎo)致的蛋白失活和細胞凋亡， 隨后是炎癥反應(yīng)和缺血導(dǎo)致的進行性損傷， 后兩者是導(dǎo)致早期燒傷創(chuàng)面加深的主要原因之一。燒傷創(chuàng)面加深最早開始于傷后3h，傷后6h 即可見創(chuàng)面明顯加深的變化，24h 更明顯，甚至持續(xù)到傷后48h 或72h[2]。 早期如何判斷并預(yù)防深Ⅱ°創(chuàng)面進一步加深是燒傷治療中必須重視、 但也是目前亟需研究解決的臨床難點之一[3]。

血管內(nèi)皮鈣粘附蛋白 （vascular endothelial cadherin,VE-cadherin） 作為血管內(nèi)皮細胞間的主要連接蛋白，在內(nèi)皮細胞連接、信號傳導(dǎo)、血管的穩(wěn)定、 抑制細胞凋亡與減少中性粒細胞在組織間隔的聚集均起不同的作用[8,9]。其主要的功能之一是通過促使同型細胞之間相互粘附， 從而達到維護內(nèi)皮細胞的完整性[4-7]。 VE-cadherin 的結(jié)構(gòu)和功能異常會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞粘附連接解離， 適度的內(nèi)皮細胞通透性增加可以促進毛細血管的生長， 但大量內(nèi)皮細胞通透性增加可造成局部組織水腫、細胞缺血缺氧，功能受限。 本研究對不同時間段不同創(chuàng)面中VE-cadherin 表達量進行檢測， 旨在探討VE-cadherin 在燒傷早期創(chuàng)面加深中的表達水平變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠36 只（生產(chǎn)廠家：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司， 許可證號：SCXK （湘）2016-0002)。

1.2 銅梳狀動物燙傷模型造模 提前準備：將動物稱重， 用10%的水合氯醛按350mg/kg 劑量腹腔內(nèi)注射麻醉， 麻醉后用脫毛膏將背部毛發(fā)脫干凈備用。燙傷：燙傷深Ⅱ°組將麻醉好的大鼠放置于實驗臺上，助手將大鼠扶好，保持即將燙傷區(qū)域的平整，將6mm 間隙銅梳燙傷器浸沒預(yù)先燒開的沸水中，均勻加熱5min，用止血鉗拿出，沾干，立即置于大鼠背部中線兩測旁開0-5cm 處皮膚，不施加壓力，制成燙傷模型；正常組大鼠不予以燙傷處理。護理：燙傷后大鼠燙傷處涂予以單層醫(yī)用凡士林油紗布覆蓋創(chuàng)面，燙傷后3h 觀察創(chuàng)面大體淤滯面積，若發(fā)生出血點或瘀斑形成等則視為壞死即屬于創(chuàng)面加深組，所有創(chuàng)面全程每日更換凡士林油紗布覆蓋保持持續(xù)保護狀態(tài)。

1.3 實驗分組 ⑴正常對照組（control）；⑵燙傷深I(lǐng)I°組（非加深組）；⑶燙傷III°組（加深組）。

1.4 實驗方法

1.4.1 HE 染色 取組織用4%多聚甲醛固定做HE染色樣本。 組織流水沖洗數(shù)小時， 經(jīng)70%、80%、90%乙醇溶液梯度脫水，無水乙醇、二甲苯1:1 混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。石蠟包埋:二甲苯和石蠟1:1 混合液15min，再分別放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟50-60min。 切片：將石蠟切片、烤片、脫蠟，水化。 染色：蘇木精水溶液中染色3min，鹽酸乙醇分化液分化15s，稍水洗，返藍液返藍15s，流水沖洗，放入伊紅液中染色3min，再次流水沖洗，脫水，中性樹脂封片后待鏡檢。

1.4.2 免疫組化 烤片，脫蠟，水化。抗原修復(fù)：將切片放入修復(fù)盒中，加入抗原修復(fù)液(檸檬酸緩沖液)置于高壓鍋加熱后自然冷卻，棄去抗原修復(fù)液，切片進行PBS 淋洗；封閉內(nèi)源性過氧化物酶：將切片移入濕盒中，用新鮮配制的3%雙氧水，室溫孵育10min，PBS 浸洗玻片3 次×5min， 吸水紙吸干組織周圍的PBS；封閉：在玻片上滴加5%BSA，37°C 封閉30min。 一抗孵育： 吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，滴加足夠量的稀釋好的一抗VE-cadherin（1:200）放入濕盒中，4 °C 孵育過夜；二抗孵育：取出4°C 孵育過夜?jié)窈校?室溫靜置45min，PBS 浸洗玻片3 次×5min，滴加辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)（1:100），37 °C 孵育30min，PBS 充分淋洗。 DAB 顯色： 在顯微鏡下掌握染色程度，PBS 或自來水沖洗1min ；蘇木精復(fù)染3min，鹽酸酒精分化，返藍，流水沖洗1min，脫水、封片后待鏡檢。免疫組化評分：用Image J pro6.0 中平均光密度值（IOD）采集VEcadherin 蛋白表達量，導(dǎo)出GraphPad Prism 作柱狀圖。

1.4.3 Western blot 取各組加入相應(yīng)的裂解液中，4℃裂解30min 后10000 rpm/min 離心10min，小心吸取上清液，得總蛋白。 BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。 蛋白變性、上樣、電泳1-2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30-50min。 4℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1-2 h。在膜上滴加ECL 曝光液，曝光。用“Image J”軟件進行灰度分析。

1.5 觀察指標 觀察VE-cadherin 蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 Image J Plus 6.0 檢測免疫組化VE-cadherin 表 達 量 平 均 光 密 度 值 （IOD）及Western Blot 蛋白灰度值， 采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析， 多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Dunnet 檢驗。采用Student t 檢驗分析創(chuàng)面組與對照組的統(tǒng)計學(xué)意義， 以P＜0.05 作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HE 結(jié)果 共11 只（加深組）大鼠出現(xiàn)創(chuàng)面加深，13 只（非加深組）未加深，圖1 所示：正常對照組各時間點皮膚組織排列整齊，非加深組（Ⅱ°）創(chuàng)面可見明顯炎性細胞浸潤、漿液及纖維素滲出，皮膚成纖維細胞數(shù)量的增加隨著時間的延長開始修復(fù)。 加深組（III°）創(chuàng)面皮膚組織大量細胞變性、壞死，炎癥細胞浸潤，隨著時間增加肉瘤組織變多，纖維束斷裂，纖維化增生。

圖1 HE 染色

2.2 免疫組化結(jié)果 如圖2 所示所示， 在時間點6h、12h、24h、48h 上，與正常對照組相比，非加深組（Ⅱ°）和 加深組（III°）創(chuàng)面皮膚組織VE-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。

圖2 免疫組化

2.3 Western Blot 結(jié)果 如圖3 所示，在時間點6h、12h、24h、48h 上，與正常對照組相比較，非加深組（Ⅱ°）和 加深組（III°）創(chuàng)面皮膚組織VE-cadherin蛋白表達顯著增加，其中加深組（III°）創(chuàng)面皮膚組織VE-cadherin 蛋白表達高于II°燙傷組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）。

圖3 Western blot

3 討論

燒傷深Ⅱ°創(chuàng)面早期普遍容易出現(xiàn)創(chuàng)面進行性加深現(xiàn)象，其加深原因較為復(fù)雜，目前仍被廣泛研究中[10]。有文獻顯示[11，13]，創(chuàng)面加深可能與毛細血管內(nèi)皮細胞通透性調(diào)控存在相關(guān)性。 燒傷后血管內(nèi)皮細胞通透性增加,出現(xiàn)炎癥細胞（如中性粒細胞、IL-8 等）在組織間隙聚集，當發(fā)生過度炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織進一步損害,創(chuàng)面加深[4]。 VE-cadherin 是血管內(nèi)皮細胞表面特異的跨膜黏附蛋白， 特異表達于內(nèi)皮細胞的鈣黏附素，研究顯示VE-cadherin在保持血管的完整性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞間的通透性，白細胞滲出以及細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)等各方面具有關(guān)鍵作用[12]。 VE-cadherin 表達增加可間接反映血管內(nèi)皮細胞損傷和血管通透性增加，VE-cadherin水平能夠反映血管內(nèi)皮損傷程度， 并可對損傷程度進行量化[8]。 由此可推測，VE-cadherin 的表達與燒傷創(chuàng)面加深可能存在一定關(guān)系， 本試驗擬探討VE-cadherin 在燒傷早期創(chuàng)面加深后表達量的變化，為臨床診斷、防治燒傷早期創(chuàng)面加深提供指導(dǎo)意見。

本實驗中加深組創(chuàng)面皮膚組織出現(xiàn)了大量細胞變性、壞死，明顯的炎癥細胞浸潤，證實了過度炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致創(chuàng)面加深的主要因素之一[13]。適度炎癥反應(yīng)可起到促進愈合的作用， 但是過度炎癥刺激可能會適得其反； 血管內(nèi)皮細胞通透性在調(diào)節(jié)炎癥和促進愈合方面具有重要作用， 血管通透性與毛細血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接、 內(nèi)皮細胞層的連續(xù)性、 毛細血管基底層完整性等因素有關(guān)，其中最重要的是內(nèi)皮細胞之間的緊密連接，而VE-cadherin 是血管內(nèi)皮細胞黏附連接的主要成分[14]。本實驗中免疫組化結(jié)果提示燒傷創(chuàng)面加深后創(chuàng)面VE-cadherin 蛋白表達顯著增加，且WB 檢測顯示在早期各時間點與對照組比較非加深燙傷組和加深燙傷組皮膚組織VE-cadherin 蛋白表達顯著增加,其中加深I(lǐng)II°燙傷組皮膚組織VE-cadherin蛋白表達高于非加深I(lǐng)I°燙傷組， 差異具有統(tǒng)計血意義（P＜0.05）。 這表明VE-cadherin 的表達與燒傷早期創(chuàng)面加深有一定關(guān)系， 在燒傷早期創(chuàng)面加深中可能起重要作用。且VE-cadherin 的表達變化可能成為判斷燒傷早期創(chuàng)面加深的參考指標， 對臨床防治燒傷早期創(chuàng)面加深具有一定的臨床意義。此外，近年來有研究表明[14]VE-cadherin 相關(guān)信號通路還可通過調(diào)節(jié)血管通透性加速創(chuàng)面愈合。 除了黏附特性之外，VE-cadherin 還參與了調(diào)節(jié)各種細胞內(nèi)進程，比如細胞增殖、凋亡與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子受體等的功能， 具體的相關(guān)機理仍有待進一步的實驗研究揭示。