胡著云，周瓊

（1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南昌330006；2.南昌市第三醫(yī)院，南昌330000）

前列腺癌（ PCa）是老年男性常見腫瘤，其死亡率也位于腫瘤疾病第二位。 加之近年來隨著生活環(huán)境的改變及普查力度的提高， 前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。 臨床治療前列腺癌的方法包括內(nèi)手術、化療、內(nèi)分泌療法、以及放射等多種療法。這些療法均具有一定的局限性， 其中手術治療效果差，化療藥物難以進入前列腺癌組織，內(nèi)分泌治療雖可改善患者癥狀， 但在接受治療的1-3 年后幾乎所有患者會轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔ˋIPC），平均預期生存時間小于1 年[1]。 因此，尋找能有效防治前列腺癌的新型藥物成為臨床急需解決的問題。

既往研究表明， 腫瘤組織生長和轉移的過程中，腫瘤細胞增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用。 白藜蘆醇（resveratrol）是虎杖的主要活性成分，研究表明其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗自由基等多種功效，其中白藜蘆醇的抗腫瘤活性已成為當前研究的熱點[2,3]。 基于此，本研究通過動物實驗研究探討白藜蘆醇誘導前列腺癌PC-3 系細胞凋亡的作用及其機制， 旨在為臨床防治前列腺癌提供新的思路和依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特殊病原體(SPF) 級BALB／C成年雄性裸鼠，體重為18-22g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.1.2 細胞及試劑 人前列腺癌PC-3 細胞株購自中科院昆明細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；β-actin 抗體，小鼠存活素(survivin)單抗、小鼠抗人bcl-2 單抗均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.1.3 中藥藥材 中藥虎杖產(chǎn)地為江西樟樹， 經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定與炮制專家鑒定為廖科植物虎杖。 采用醇提-樹脂分離工藝提取藥物中的白藜蘆醇成分， 并采用萃取和硅膠柱層析相結合的方法，最終得到含90%白藜蘆醇的提取物。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立裸鼠模型 將人前列腺癌PC-3 細胞株常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，取對數(shù)生長期的PC-3 細胞消化，計數(shù)活細胞數(shù)在98%，調(diào)整濃度為（5-10）×106/ml，取0.2ml 細胞懸液接種于裸鼠背部皮下當移植瘤長至1×1cm 時開始治療。

1.2.2 分組治療 選取48 只已長瘤裸鼠， 實體瘤體積和體重接近，隨機分為空白組、對照組以及治療A、B、C、D 共6 組，每組8 只。 其中空白組生理鹽水0.1 ml/只，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；對照組：丙二醇0.1 ml/只，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治療A 組：白藜蘆醇25mg/kg，溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治療B 組： 白藜蘆醇50mg/kg， 溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治療C 組：白藜蘆醇100mg/kg， 溶于0.1 ml 丙二醇中， 腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治療D 組：白藜蘆醇200mg/kg，溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3天一次，共10 次。

1.3 觀察指標 ⑴分別于第5d、第10d、第20d 以及第30d 測量并記錄腫瘤體積[腫瘤體積（mm3）=長徑(mm)×短徑2(mm2)×0.5)]。⑵治療結束后處死裸鼠，剝離瘤體稱重后計算抑瘤率。 抑瘤率=(對照組平均瘤重一實驗組平均瘤重)／對照組平均瘤重×100%。 ⑵取下腫瘤組織，采用Western blot 檢測各組腫瘤標本的Bcl-2 和Survivin 的表達情況。操作方法：每組分別取腫瘤組織40mg，低溫勻漿器研磨后提取總蛋白60μg 上樣，經(jīng)PAGE 電泳、脫脂奶粉封閉、孵育過夜等程序后，采用增強化學發(fā)光法檢測目標蛋白，其中蛋白含量相對值=蛋白光密度值/β-actin 光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間采用方差檢驗，計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對移植瘤腫瘤體積的影響 對照組裸鼠平均腫瘤體積從 (160.48±17.46)mm3增長到(1149.3±221.3)mm3；空白組和對照組不同時期移植瘤腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療組A 和B 組中，隨著時間的推移，移植瘤腫瘤體積增加，不同時間段間比較差異顯著（P＜0.05）；隨著白藜蘆醇濃度的增加，移植瘤腫瘤體積明顯下降，各組間比較差異顯著（P＜0.05）。 見表1。

表1 不同組別移植瘤腫瘤體積比較（±s），mm3

表1 不同組別移植瘤腫瘤體積比較（±s），mm3

組別 5d 10d 20d 30d對照組空白組治療組A 組B 組C 組D 組160.48±17.46 161.07±19.01 325.74±24.95 334.61±22.98 857.13±76.94 867.94±77.30 1149.31±221.37 1204.28±234.16 123.24±20.07 114.95±18.63 104.15±17.57 95.52±15.26 249.34±23.94 186.37±21.86 153.07±20.04 117.28±16.31 519.36±42.38 264.27±29.34 194.38±22.08 130.71±17.05 702.19±68.37 311.75±34.19 226.07±27.64 157.33±20.14

2.2 白藜蘆醇對移植瘤平均腫瘤重量及抑瘤率的影響 對照組移植瘤腫瘤平均重量為 （0.562±0.005）g， 對照組和空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療組A-D 組中，隨著白藜蘆醇濃度的增加， 移植瘤腫瘤重量明顯下降， 抑瘤率明顯提高，各組間比較差異顯著（P＜0.05）。 見表2。

2.3 不同組別Bcl-2 和Survivin 表達比較 對照組和空白組Bcl-2 和Survivin 表達明顯，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）； 治療組移植瘤組織中Bcl-2 和Survivin 表達不同程度減少， 并呈劑量依賴性，隨著白藜蘆醇濃度的增加，Bcl-2 和Survivin蛋白的平均光密度均明顯下降， 各組間比較差異顯著（P＜0.05）。 見表3。

表2 不同組別移植瘤腫瘤重量比較（±s）

表2 不同組別移植瘤腫瘤重量比較（±s）

組別 平均腫瘤重量(g) 抑瘤率(%)對照組空白組治療組A 組B 組C 組D 組0.562±0.005 0.571±0.005——0.446±0.004 0.382±0.004 0.319±0.003 0.256±0.002 20.64 32.03 43.24 54.45

表3 不同組別Bcl-2 和Survivin 表達比較

3 討論

細胞凋亡是程序性細胞死亡過程， 其中由凋亡產(chǎn)生的損傷作用與腫瘤的發(fā)生關系密切， 同時凋亡產(chǎn)生的損傷作用也是惡性腫瘤發(fā)展的關鍵特征之一，因此，誘導腫瘤細胞凋亡是有最有效的化療策略。 細胞凋亡通常由內(nèi)源和外源兩種途徑來介導，Survivin（存活素），屬凋亡抑制蛋白，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞分裂的雙重功能， 其在正常成人組織中幾乎不表達， 但在大多數(shù)腫瘤中可重新出現(xiàn)。 研究表明，Survivin 具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的雙重功能， 與前列腺癌的發(fā)生密切相關。 國外研究表明，Survivin 在前列腺癌的高水平表達與腫瘤的分期、 分級明顯相關[4]。Elena 等通過抑制survivin 基因導致細胞活性降低，最終則導致Hela 細胞線粒體跨膜電位缺失、細胞自發(fā)性凋亡。 Bcl-2 蛋白是第一個確認能對抗細胞凋亡的基因，是細胞凋亡的關鍵調(diào)控者[5]。 其作用機制是通過線粒體外膜達到調(diào)節(jié)細胞凋亡。 研究表明Bcl-2 過表達促進了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展，同時也與疾病的臨床病理特征有關[6,7]。

基于以上理論， 臨床研究治療前列腺癌的關鍵在于尋找能有效干預細胞凋亡抑制蛋白的藥物。 白藜蘆醇是虎杖的主要活性成分， 具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、和免疫調(diào)節(jié)等作用，已被證明對乳腺癌、 卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[8-10]。 為進一步探討白藜蘆醇抗前列腺癌的可能機制， 本研究對其進行裸鼠動物實驗研究。 研究中將48 只長瘤裸鼠分為六組，結果表明， 空白組和對照組移植瘤腫瘤體積、Bcl-2 和Survivin 蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。 治療組給予不同劑量的白藜蘆醇，25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 以及200mg/kg 移植瘤腫瘤體積依次遞減，抑瘤率依次遞增，并呈劑量依賴性，各組間比較差異顯著（P＜0.05），進一步證明表明白藜蘆醇對前列腺腫瘤有抑制作用。 此外，通過對白藜蘆醇抑瘤機制的分析， 結果顯示治療組中， 白藜蘆醇25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 以 及200mg/kg 移 植 瘤 組 織 中Bcl-2 和Survivin 表達不同程度減少， 各組間比較差異顯著（P＜0.05），并呈劑量依賴性，隨著白藜蘆醇濃度的增加，Bcl-2 和Survivin 蛋白的平均光密度均明顯下降。由此表明白藜蘆醇對PC-3 細胞具有顯著的細胞毒作用， 并以劑量依賴性方式通過誘導細胞凋亡來抑制PC-3 細胞的增殖，其機制可能與白藜蘆醇通過抑制Bcl-2 和Survivin 蛋白的表達而阻斷信號通路有關。