諶衛(wèi)龍，李衛(wèi)明，張守華，雷俊，涂小飛，曾俊權(quán)

（江西省兒童醫(yī)院，1.普外科；2.檢驗(yàn)科，南昌330006；3.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉安343009）

黃芪為補(bǔ)虛良藥，廣泛地應(yīng)用于臨床[1]，但同時(shí)由于中藥藥物成分復(fù)雜， 在臨床應(yīng)用中引起一些問題，比如對腎功能損害、過敏發(fā)應(yīng)等。 因此，利用現(xiàn)代中藥藥物提純技術(shù)尋找出并利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證中藥的有效成分是改善中藥不良反應(yīng)的主要方法。黃芪總黃酮（TFA）是從中藥黃芪中分離的主要活性成分，在多種方劑中均有應(yīng)用，既往文獻(xiàn)報(bào)道其具有抗氧化、保肝、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒等多種生物學(xué)作用[2-4]。 也有報(bào)道黃芪能改善紅細(xì)胞變形能力， 降低纖維蛋白原及全血比黏度，抑制血小板黏附[5,6]。 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪總黃酮改善肝纖維化的效果及機(jī)制。 據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，初步探討黃芪的主要有效成分黃芪總黃酮 （total flavonoids of astragalus，TFA） 對改善肝纖維化效果和機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 32 只SPF 級SD 大鼠， 重量180-220g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，所有動(dòng)物普通飲食，自由飲水。

1.1.2 試劑儀器黃芪總黃酮購于南京春秋生物工程有限公司；四氯化碳購于上海試劑三廠；RNA 提取試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR 試劑盒購自全式金生物有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH） 測試盒購自南京建成生物工程研究所；NF-κB、TNF-α、FXR 多克隆一抗和多克隆二抗購自Abcam 公司； 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為4 組：正常組（Normal）、模型組（Model）、TFA 高劑量 組、TFA低劑量組，每組8 只。用CCl4誘導(dǎo)大鼠形成肝纖維化模型。 除正常組，其余三組給予40% CCL4橄欖油混合液皮下注射，每周2 次，共8 周。 第5 周開始，TFA 低劑量組和TFA 高劑量組給15mg/kg 和30mg/kg 的TFA 灌胃，1 次/日，治療4 周，模型組予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集8 周后，采腹腔靜脈血，分離血清，用于AST、ALT、ALB 等肝功能檢測；取部分肝葉用4% 甲醛溶液固定做常規(guī)組織病理學(xué)觀察，另一部分用于做Western blot、定量PCR、MDA、SOD、GSH等檢測。

1.2.3 肝功能等指標(biāo)檢測 應(yīng)用全自動(dòng)生化儀器檢測血清AST、ALT、ALB 等含量。 各組肝組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明書檢測MDA、SOD、GSH 等氧化水平。

1.2.4 Realtime PCR 法檢測肝組織中相關(guān)炎癥因子的表達(dá) 根據(jù)試劑盒提取肝組織總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，按照說明書進(jìn)行擴(kuò)增，檢測NF-κB、TNF-α、FXR 的mRNA，以βactin 作為內(nèi)參。 引物序列如下：β-actin 上游：5’-TTCAACACCCCAGCCATGT -3’， 下 游 ：5’ -GCATACAGGGACAACACAGCC-3’；NF-κB 上 游5’-TCTGTTTCCCCTCATCTTTCCC-3’， 下游5’-GTCTTAGTGGTTCTGTGCTTCTC-3’；TNF-α 上 游5’-CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTC-3’，下游5’-CTGCTTGGTGGTTTGCTACG-3’；FXR 上 游5’-TGGACTCATACAGCAAAC AGAGA-3’， 下游5’-GTCTGAAACCCTGGAAGTCTTTT-3’

1.2.5 Western blot 分析 取各組肝組織用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。 蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳分離， 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%BSA 封閉，加入TNF-α （1:1000）、FXR （1:1000）、NF-κB（1:2000）多克隆一抗及β-actin（1:2000）一抗，4℃孵育過夜。Quantity One 4.0 軟件進(jìn)行條帶灰度分析。β-actin 作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。 數(shù)據(jù)采用(±s)表示，組間或組內(nèi)采用ANOVA-One 分析, 方差不齊時(shí)采用Tamhane’T2分析。

2 結(jié)果

2.1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響 與正常組比較， 皮下注射CCl48 周能造成明顯的肝纖維化及肝損傷， 模型組與正常組相比AST、ALT明顯升高，ALB 下降（P＜0.05）；TFA 可以明顯減輕CCL4引起的肝功能異常（P＜0.05），較模型組相比AST、ALT 降低（P＜0.05），ALB 升高（P＜0.05），并且TFA 高劑量組較低劑量組有更好的護(hù)肝降酶作用（表1）。

表1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響(±s)

表1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響(±s)

#P＜0.05 vs Normal, *P＜0.05 vs Model,& P＜0.05 vs Low TFA

分組 AST(U/L) ALT(U/L) ALB(g/L)Normal（8 例）Model（8 例）Low TFA（8 例）High TFA（8 例）35.13±5.38#*&23.63±3.81#&28.25±3.20#*29.13±4.79#*111.38±14.30*&559.38±66.26#&415.75±58.95#*278.88±62.47#*&45.75±8.68*&430.75±41.35#&339.38±65.42#*255.38±44.47#*&

2.2 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟病理改變及膠原纖維的影響 HE 染色可見正常組大鼠肝細(xì)胞大小正常，形態(tài)規(guī)則，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整（Fig1 A），模型組大鼠肝組織HE 染色可見肝細(xì)胞壞死、脂肪變性，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝索排列紊亂，肝組織匯管區(qū)間、匯管區(qū)與中央靜脈間大量纖維組織形成并可見假小葉形成（Fig1B）。 經(jīng)TFA 治療4 周后，低劑量組仍可見肝纖維化(箭頭所示纖維化改變)，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整， 可見明顯的細(xì)胞脂肪變以及炎性細(xì)胞浸潤（Fig1C），高劑量組顯示肝纖維化程度減輕，少量的細(xì)胞脂肪變以及炎性細(xì)胞浸潤（Fig1D）。

圖1 小鼠肝臟HE 染色圖

2.3 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關(guān)炎癥因子及FXR mRNA 表達(dá)的影響 與正常組相比， 模型組NFκB、TNF-α mRNA 水平明顯升高 （P＜0.05），F(xiàn)XR mRNA 水平降低（P＜0.05）。 經(jīng)過TFA 治療4周后， 與模型組對比， 均明顯抑制肝組織中NFκB、TNF-α mRNA 表達(dá)， 上調(diào)FXR mRNA 的表達(dá)（Fig2）。 其中，高劑量組更為明顯，說明高劑量組TFA 有較好的抗炎效果。

2.4 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關(guān)炎癥因子及FXR 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較， 模型組NF-κB、TNF-α 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），F(xiàn)XR 蛋白水平降低（P＜0.05）。 經(jīng)過TFA 治療4 周后，與模型組對比，均明顯抑制肝組織中NF-κB、TNF-α 蛋白表達(dá)，上調(diào)FXR 蛋白的表達(dá)（Fig3）。 其中，高劑量組更為明顯， 結(jié)果與mRNA 水平一致， 說明TFA有較好的抗炎效果。

2.5 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟過氧化相關(guān)指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組MDA 升高（P＜0.05），GSH、SOD 水平降低（P＜0.05）。 經(jīng)過TFA 治療4 周后，與模型組對比，明顯下調(diào)肝組織中MDA 水平，上調(diào)GSH、SOD（P＜0.05）（Fig4）。 其中，高劑量組更為明顯， 說明TFA 有較好的抗過氧化損傷作用。

圖2 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關(guān)炎癥因子及FXR mRNA 表達(dá)的影響

圖3 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關(guān)炎癥因子及FXR 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝纖維化是以各種因素如乙肝、毒素和藥物、寄生蟲、酒精、肝淤血、遺傳代謝性疾病等導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，刺激纖維結(jié)締組織異常增生，膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增生與降解失衡，最終過度沉積在肝臟組織，是多種慢性肝臟疾病中晚期共有的病理生理過程[7-9]。 傅纓等的研究顯示， 發(fā)酵蟲草菌粉可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）及降低金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化作用[10]。 肝纖維化在早期階段是可以逆轉(zhuǎn)的， 但若致病因素持續(xù)存在， 長時(shí)間的肝臟炎癥、 肝纖維化可進(jìn)展為肝硬化，此階段病變難以逆轉(zhuǎn)，部分可導(dǎo)致肝細(xì)胞癌。四氯化碳（CCl4）是一種十分經(jīng)典的急慢性肝損傷造模毒物，廣泛應(yīng)用于肝臟疾病等基礎(chǔ)研究[11]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合既往前期的造模經(jīng)驗(yàn)， 采用CCl4皮下注射方法，8 周后成功構(gòu)建大鼠肝纖維化模型[12]。 模型大鼠可見肝臟纖維化改變， 肝細(xì)胞可見脂肪變性以及壞死，這與人體肝纖維化病理改變類似。 本實(shí)驗(yàn)在造模第四周即開始給予TFA 治療， 與第一天即開始給藥治療相比， 此時(shí)間點(diǎn)給藥更符合人類患病后治療過程。

已有眾多研究證明， 許多慢性疾病包括腫瘤以及心血管、內(nèi)分泌、消化系統(tǒng)等疾病均與人體內(nèi)蓄積過多的氧自由基有一定關(guān)系[13-15]。 機(jī)體是通過酶和抗氧化物來清除有害自由基的， 比如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等。 當(dāng)機(jī)體受到有害物質(zhì)等攻擊時(shí)， 大量的氧和自由基的釋放，搶奪其他分子包括蛋白質(zhì)、脂類、糖類等以及脫氧核糖核酸上的電子， 在此過程中將產(chǎn)生更多的自由基，引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，當(dāng)機(jī)體天然的防御機(jī)制不能根除這些自由基時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜被侵蝕，細(xì)胞完整性喪失等。 戴穎等的研究顯示熊果酸可通過阻斷氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化過程,增加細(xì)胞ECM 的降解,并減少ECM 的沉積等機(jī)制，治療大鼠肝纖維化[16]。

TFA 在清除自由基作用方面已有相關(guān)報(bào)道，并且在心肌、肝臟、肺等組織器官均可經(jīng)抗氧化而發(fā)揮藥理作用[17,18]。 有研究報(bào)道TFA 可增加急性心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流及改善心臟血流動(dòng)力學(xué), 并且可有效的維護(hù)心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[19]。 在肺纖維化方面，徐昌君等通過博萊霉素構(gòu)建肺纖維化小鼠，后給予黃芪多糖、黃芪皂苷以及黃芪黃酮, 發(fā)現(xiàn)黃芪黃酮改善肺纖維化效果最為理想,并發(fā)現(xiàn)TFA 可通過抑制TGF-β 和TNF-α 表達(dá)而抑制肺纖維化的進(jìn)程[20]。 麥靜愔等發(fā)現(xiàn)TFA 可下調(diào)大鼠脂肪酸轉(zhuǎn)位酶和環(huán)氧化酶-2 的表達(dá)，對肝組織的膠原增生有明顯的抑制作用而改善肝纖維化進(jìn)程[21]。 本實(shí)驗(yàn)利用CCl4構(gòu)建肝纖維化模型后給予不同劑量的TFA， 亦發(fā)現(xiàn)可以改善肝纖維化大鼠肝功能，下調(diào)TNF-α 等炎性蛋白指標(biāo)，并且高劑量組TFA 更為明顯。 進(jìn)一步檢測SOD、MDA等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，TFA 亦可明顯改善肝臟過氧化損傷。

法尼酯衍生物X 受體( FXR)是一種膽汁酸受體,屬于核受體超家族，在消化、泌尿等系統(tǒng)的組織器官均高表達(dá)。 在消化系統(tǒng)中廣泛參與膽汁酸、膽固醇代謝以及糖代謝[22,23]。 當(dāng)配體與FXR 結(jié)合后,FXR 的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并被活化， 活化的FXR與視黃醇類X 受體α （retinoid X receptor α，RX Rα）形成異二聚體,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 近來研究更發(fā)現(xiàn)FXR 具有顯著的抗腫瘤功能, 調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等過程[24,25]。陳科全發(fā)現(xiàn)FXR 激動(dòng)劑GW 4064 能導(dǎo)致HSC-T6 細(xì)胞株TIMP-1 及TIMP-2表達(dá)減少，減弱對MMP 的降解，最終增強(qiáng)MMP 降解ECM 的能力，從而緩解肝纖維化[26]。 激動(dòng)FXR能抑制細(xì)胞凋亡，并阻止肝纖維化進(jìn)程[27]，本實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)TFA 能上調(diào)肝臟FXR 的表達(dá)，這可能解釋了TFA 改善肝纖維化的作用機(jī)制。 綜上所述，TFA 能改善肝纖維化的進(jìn)程， 其機(jī)制可能與改善過氧化損傷、上調(diào)FXR 的表達(dá)有關(guān)，具有很好的開發(fā)和應(yīng)用前途。

圖4 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟過氧化相關(guān)指標(biāo)的影響