丁昭寧，白文學(xué)，劉文蘭，劉靜，王曉玲，李楊，蘇健，鄧翠平

（重慶市江津區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，重慶402260）

染色體拷貝數(shù)變異（chromosome copy number variation，CNV）是引起人類遺傳變異的重要形式之一， 其廣泛存在于人類基因組之中。 研究顯示，CNV 是由于基因組重排引起的結(jié)構(gòu)變異， 多表現(xiàn)為亞顯微水平基因組片段的微重復(fù)/微缺失等[1]。目前， 多種侵入性篩查手段在產(chǎn)前檢查中能夠檢出染色體微重復(fù)/微缺失，如核型分析、比較基因組雜交、熒光原位雜交及微陣列技術(shù)等，不過此類檢查手段存在一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[2,3]，臨床應(yīng)用存在一定局限性。 對此，尋找一種高精度且非侵入性的產(chǎn)前檢測手段以提高CNV 檢出率具有重要臨床價(jià)值。 本研究通過收集近年收治的接受無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（NIPT-plus）孕婦的臨床資料，并與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行一致性比較，旨在觀察NIPTplus 在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測CNV 中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年3 月-2020 年3 月在江津區(qū)婦幼保健院產(chǎn)檢中接受NIPT-plus 檢測孕婦1014 例作為研究對象，年齡24-43 歲，平均（33.1±5.2）歲；孕周13-27 周，平均（22.3±1.0）周。 納入標(biāo)準(zhǔn)：孕婦為B 超軟指標(biāo)異常、高齡妊娠（分娩年齡≥35 歲）、 血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)者，懷疑胎兒CNV；均經(jīng)孕婦同意并簽署知情同意書后采集其外周血作為檢測樣本；排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎及雙胎妊娠者；孕婦1 個(gè)月內(nèi)接受過免疫治療、干細(xì)胞治療、 移植手術(shù)者及一年內(nèi)接受過異體輸血者。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 方法

1.2.1 NIPT-plus 檢測 ⑴樣本采集：采用EDTA 抗凝管采血管抽取孕婦7-10ml 外周靜脈血，在預(yù)冷離心機(jī)（4℃）內(nèi)以1600r/min 的速率離心10min，收取上層血漿，并對初步分離的血漿再次離心，目的在于去除殘存細(xì)胞。⑵提取游離DNA：采用磁珠法從合格血漿樣本中裂解、 分離、 純化并提取游離DNA，提取游離DNA 過程中需建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制體系，確保所提取的游離DNA 質(zhì)量合格，能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求， 并確保其片段多態(tài)性有足夠代表性。 ⑶制備測序文庫：提取好的DNA 進(jìn)行末端修復(fù)、補(bǔ)平，并進(jìn)行測序接頭、擴(kuò)增及純化，文庫的制備要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行， 文庫構(gòu)建后的DNA 濃度要大于0.2ng/mg， 同時(shí)片段長度要在150-200bp 范圍內(nèi)[4]。⑷基因測序及數(shù)據(jù)分析：采用NextSeq CN500 高通量測序儀檢測分析特定DNA片段的堿基序列， 并采用生物信息工具放大并分析不同染色體水平差異， 識(shí)別胎兒染色體非整倍體異常及相對高發(fā)的幾種微缺失疾病， 最終確定胎兒罹患染色體非整倍性疾病種類及風(fēng)險(xiǎn)概率。對NIPT-plus 檢測結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)者進(jìn)行遺傳咨詢，并征得孕婦知情同意前提下進(jìn)行介入產(chǎn)前診斷。

1.2.2 羊水染色體核型分析 通過超聲引導(dǎo)定位，然后經(jīng)腹羊膜腔穿刺抽取孕婦羊水20ml， 離心后取0.5ml 沉淀、培養(yǎng)，得到分裂中期細(xì)胞，然后經(jīng)過低滲、固定、吉姆薩染色等處理，最終進(jìn)行染色體核型分析。

1.2.3 隨訪 通過電話或查閱本院電子病歷記錄等方式隨訪NIPT-plus 檢測陰性孕婦的妊娠結(jié)局，包括有無流產(chǎn)、新生兒是否異常等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件做數(shù)據(jù)分析，用n(%)表示計(jì)數(shù)資料，并計(jì)算NIPT-plus 檢查胎兒CNV 的陽性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 NIPT-plus 檢測結(jié)果及陽性預(yù)測值 本組1014例高風(fēng)險(xiǎn)或B 超軟指標(biāo)異常孕婦經(jīng)NIPT-plus 檢測，共檢出18-三體高風(fēng)險(xiǎn)3 例，21-三體高風(fēng)險(xiǎn)4例，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)1 例， 微缺失3 例， 微重復(fù)2例，XO 高風(fēng)險(xiǎn)1 例，XXY 高風(fēng)險(xiǎn)1 例，45，XO 高風(fēng)險(xiǎn)1 例， 詳見表1。 羊水染色體核型分析確診為18-三體高風(fēng)險(xiǎn)3 例，陽性預(yù)測值100.0%；確診為21-三體高風(fēng)險(xiǎn)4 例，陽性預(yù)測值100.0%，確診為13-三體高風(fēng)險(xiǎn)1 例，陽性預(yù)測值100%，確診為微缺失/微重復(fù)3 例，陽性預(yù)測值60%，確診為性染色體異常2 例，陽性預(yù)測值66.7%。

2.2 隨訪結(jié)果 本組接受NIPT-plus 檢測為陰性的998 例孕婦均獲得隨訪并獲知妊娠結(jié)局，無流產(chǎn)現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)新生兒染色體異常現(xiàn)象。

3 討論

NIPT 是一種通過對孕母外周血胎兒游離的基因（DNA）進(jìn)行測序及生物信息分析的新方法，其在篩查胎兒染色體非整倍體患病風(fēng)險(xiǎn)方面可提供重要依據(jù)[5,6]，具有無創(chuàng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來已逐步在臨床推廣應(yīng)用。 NIPT 以檢測21-三體、18-三體、13-三體等疾病為主要目標(biāo)， 其檢測準(zhǔn)確性幾乎達(dá)100%，不過對于染色體微重復(fù)/微缺失綜合征缺乏有效的篩查指征[7,8]。 值得慶幸的是，貝瑞和康生物公司近年推出了升級(jí)版NIPT（NIPT-plus），其通過加深測序深度并以創(chuàng)新性的生物信息學(xué)算法大大增加了檢測范圍， 使得CNV 的檢出率明顯升高[9,10]。 目前，關(guān)于NIPT 在21-三體、18-三體、13-三體等疾病診斷中的價(jià)值研究較多， 但關(guān)于NIPT-plus 在胎兒染色體微重復(fù)/微缺失中的評(píng)估價(jià)值尚鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，1014 例風(fēng)險(xiǎn)樣本接受NIPT-plus 檢測后共檢出18-三體高風(fēng)險(xiǎn)3 例，21-三體高風(fēng)險(xiǎn)4 例，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)1 例， 微缺失/微重復(fù)5 例，性染色體非整倍體3 例，經(jīng)過核型分析顯示，NIPT-plus 在檢測18-三體、21-三體、13-三體中的陽性預(yù)測值均達(dá)100.0%， 與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本吻合[11,12]，其對微缺失/微重復(fù)的陽性預(yù)測值為60.0%， 性染色體異常陽性預(yù)測值為66.7%， 提示NIPT-plus 檢測在評(píng)估CNV 風(fēng)險(xiǎn)方面有確切價(jià)值，但仍存在一定局限。 從本研究結(jié)果來看，NIPTplus 在檢測微缺失/微重復(fù)及性染色體異常中均存在假陽性病例，分析可能原因?yàn)椋菏紫?，限制性胎盤嵌合、母體染色體嵌合、性染色體互換、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞等因素均有可能導(dǎo)致NIPT-plus 提示性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)[13]；其次，NIPT-plus 檢測中也會(huì)受到孕婦自身異常DNA 的干擾[14,15]，從而導(dǎo)致無創(chuàng)結(jié)果與核型分析結(jié)果不符。 本研究中1 例微重復(fù)病例及1 例XO 高風(fēng)險(xiǎn)病例與核型分析結(jié)果不一致， 經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)孕婦繼續(xù)妊娠且新生兒出生后未發(fā)現(xiàn)異常， 出現(xiàn)假陽性可能是因?yàn)榇? 例患者是由于染色體微小片段的重復(fù)或異常所致，而NIPT-plus 檢測可能對此還不夠靈敏， 這提示NIPT-plus 檢測還存在技術(shù)本身上的缺陷或不足。本研究的主要目的在于觀察NIPT-plus 檢測在提高產(chǎn)前CNV 篩查的準(zhǔn)確性中的臨床價(jià)值， 從而為降低產(chǎn)前診斷的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)，NIPT-plus 的無創(chuàng)性、準(zhǔn)確性獲得診斷醫(yī)師的普遍認(rèn)可，不過其也存在假陽性，且費(fèi)用較高，可能造成產(chǎn)前過度診斷， 因此建議在臨床中可作為高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前篩查的一種有效補(bǔ)充。 同時(shí)，本研究樣本量較少，故所得結(jié)果還需加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，NIPT-plus 作為NIPT 的升級(jí)版，其在CNV 的檢測中對常見疾病如18-三體、21-三體中的陽性預(yù)測值較高，而在微缺失/微重復(fù)、性染色體異常等的檢測中陽性預(yù)測值尚有待提高， 希望隨著檢測技術(shù)的提高，NIPT-plus 在有效指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育方面發(fā)揮更大作用。

表1 NIPT-plus 與羊水染色體核型分析結(jié)果比較