呂慶福 過兆基 姜 敏

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科,蘇州 215006)

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，全球癌癥統(tǒng)計顯示，2018年全球乳腺癌新增女性患者208.9萬例，占所有女性癌癥發(fā)病率的24.22%，而因乳腺癌死亡的女性患者高達(dá)62.67萬例，占所有女性癌癥死亡率的15.03%，如此高的發(fā)病率與死亡率給女性的生活質(zhì)量與健康安全帶來極大威脅[1]。目前臨床上關(guān)于乳腺癌的治療方案主要以手術(shù)治療為主，但多數(shù)患者入院就診時病程已達(dá)中晚期，錯過了最佳治療時機(jī)，臨床上需采用化療等方案進(jìn)行治療[2]。雖然化療在改善乳腺癌患者生存與預(yù)后方面具有顯著效果，但臨床上關(guān)于晚期乳腺癌患者化療后療效評估的指標(biāo)較少[3]。目前臨床上主要通過影像學(xué)檢測評估患者病情，但影像學(xué)檢測對患者身體具有一定損害，相對于影像學(xué)檢測，血清學(xué)檢測具有費(fèi)用低、時間短的特點(diǎn)[4]。因此，尋找出一種特異度與靈敏度較高的血清學(xué)指標(biāo)對患者預(yù)后的預(yù)測十分關(guān)鍵。

近年來miRNA受到眾多學(xué)者關(guān)注，其作為一類長度約為22 nt的非編碼短鏈RNA，主要作用是通過對其下游靶基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)進(jìn)行完全或不完全結(jié)合互補(bǔ)從而影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制其翻譯，起到調(diào)控蛋白表達(dá)的作用[5-7]。研究顯示，miRNA可調(diào)節(jié)人體中大部分的基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡過程中具有重要作用[8]。有研究報道m(xù)iR-27在乳腺癌中存在差異表達(dá)，有望成為乳腺癌的潛在診斷指標(biāo)[9]。IL-10作為一種抑炎因子，其抑制作用在多種細(xì)胞中皆有所效果，此類因子的主要功能是抑制由特異與非特異免疫反應(yīng)引起的組織損傷，增強(qiáng)患者免疫系統(tǒng)功能，具有“清道夫”的作用[10]。然而關(guān)于miR-27與IL-10能否作為晚期乳腺癌患者療效的預(yù)測指標(biāo)尚不明確。本研究探究了miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者治療前后的表達(dá)及臨床意義，為臨床療效觀察提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1患者臨床資料 收集2014年5月～2015年9月于本院治療的晚期乳腺癌患者60例作為本次觀察組，另收集同期健康志愿者50例作為對照組，其中對照組志愿者年齡(50.2±7.2)歲，觀察組患者年齡(49.0±6.2)歲，臨床分期Ⅲ期18例，Ⅳ期42例；浸潤性導(dǎo)管癌32例，浸潤性小葉癌14例，髓樣癌9例，硬癌5例；TNM分期Ⅱb期40例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例；激素受體ER+/PR+33例，ER-/PR-27例，兩組患者年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均通過病理及免疫組化檢測確診為乳腺癌；患者病灶可被測量；患者預(yù)計生存時間≥3個月；患者臨床資料齊全，配合治療與隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：男性患者；患者存在先天性心、腎、肝、肺功能缺陷；患者存在免疫性缺陷疾病，不配合治療；患者治療前存在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷；患者合并其他惡性腫瘤。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；吡柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；環(huán)磷酰胺(baxter oncology GmbH，進(jìn)口藥品注冊證號：H20160467)；地塞米松(上海上藥信誼藥廠有限公司)；托烷司瓊(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，奧美拉唑(常州四藥制藥有限公司)；EasyPure miRNA Kit、TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京TransGen Biotech公司，ER601-01，AQ202-01)；IL-10 ELISA試劑盒(中國上海Beyotime Biotechnology公司，PI528)。

1.2方法

1.2.1治療方案 患者治療前3 d口服地塞米松藥物5 mg，1次/d，化療前30 min采用托烷司瓊與奧美拉唑治療，托烷司瓊5 mg，1次/d，奧美拉唑20 mg，2次/d，口服，具體化療方案如下：第1天，靜脈注射多西他賽75 mg/m2，環(huán)磷酰胺600 mg/m2，吡柔比星40 mg/m2，3周為1個療程，治療2個療程后評估患者臨床療效。

1.2.2樣本收集 收集觀察組患者治療前后及健康志愿者空腹外周血靜脈5 ml，靜置30 min后，以3 000 r/min 離心10 min，收集上清，即刻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3指標(biāo)檢測

1.2.3.1qRT-PCR檢測miR-27 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度儀與瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純度、濃度與完整性。按照試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O補(bǔ)全體系至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本研究以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt對本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。miR-27 F:5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，R:5′-AGGGCTTAGCTGCTTGTGA-GCA-3′，U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3.2EILSA檢測IL-10 將收集到的血清分別加入50 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液并置于空白微孔；空白對照孔加入50 μl蒸餾水和50 μl抗體；其余微孔中先加入樣品40 μl，再加入生物素標(biāo)記的抗體10 μl。封板后37℃溫育30 min，洗板時每孔洗滌液保證滿而不溢靜置30 s棄去洗滌液，拍干，重復(fù)5次，各孔加入50 μl酶標(biāo)溶液，再次封板，37℃溫育60 min，洗板共5次，最后1次使用吸水紙徹底拍干，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記(100 μl/孔)后封板，37℃下避光溫育15 min，以100 μl/孔加入顯色底物TMB，室溫避光孵育20 min，最后加入終止液(50 μl/孔)，15 min內(nèi)酶標(biāo)儀檢測，測定450 nm處最大吸收波長。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4患者生存隨訪 對患者進(jìn)行為期3年的生存隨訪，隨訪方式采用電話與門診復(fù)查的方式進(jìn)行，隨訪時間為每3個月1次。

1.2.5療效評估標(biāo)準(zhǔn) 患者進(jìn)行為期2個療程的治療后行臨床療效評估，根據(jù)MRI與CT結(jié)果計算患者腫瘤大小變化，根據(jù)RECIST實(shí)體瘤緩解評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效分級：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)[11]。

1.2.6觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)：比較觀察組與對照組miR-27與IL-10表達(dá)情況，觀察患者治療前后miR-27與IL-10表達(dá)變化，根據(jù)患者生存情況繪制生存曲線，根據(jù)治療前miR-27與IL-10表達(dá)中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，觀察miR-27與IL-10高、低表達(dá)在患者生存中的價值。次要觀察指標(biāo)：觀察患者臨床療效，根據(jù)臨床療效將患者分為療效優(yōu)秀組與療效較差組比較兩組患者治療前miR-27與IL-10表達(dá)，繪制受試者工作(ROC)曲線，分析治療前miR-27與IL-10的表達(dá)在療效中的預(yù)測價值。

2 結(jié)果

2.1miR-27與IL-10在兩組中表達(dá) 結(jié)果表明，對照組受試者血清中miR-27表達(dá)(1.027±0.08)明顯低于觀察組患者(1.475±0.178)(t≤16.379，P<0.001)，IL-10表達(dá)(12.432±1.978)pg/ml明顯高于觀察組患者(7.716±1.205)pg/ml(t≤15.356，P<0.001)。見圖1。

圖1 miR-27與IL-10在對照組與觀察組中的表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-27 and IL-10 in control group and observation groupNote:***.P<0.001.

2.2觀察組患者治療后血清中miR-27與IL-10表達(dá)變化 觀察組患者治療后血清中miR-27表達(dá)(1.241±0.104)明顯低于治療前(1.475±0.178)(t=9.147，P<0.001)，IL-10表達(dá)(10.702±1.566)pg/ml明顯高于治療前(7.716±1.205)pg/ml(t=11.561，P<0.001)，見圖2。

圖2 觀察組患者治療前后血清中miR-27與IL-10表達(dá)比較Fig.2 Comparison of expressions of miR-27 and IL-10 in serum of patients in observation group before and after treatmentNote:***.P<0.001.

2.3治療前miR-27與IL-10表達(dá)在臨床療效中的預(yù)測價值 觀察組患者通過治療后，共有CR患者17例，PR患者21例，SD患者15例，PD患者7例，根據(jù)患者臨床療效將CR+PR患者分為療效優(yōu)秀組(EC group)(n=38)，SD+PD患者分為療效較差組(PC group)(n=22)，比較兩組患者治療前血清中miR-27與IL-10表達(dá)發(fā)現(xiàn)，療效優(yōu)秀組患者血清中miR-27表達(dá)(1.425±0.188)明顯低于療效較差組(1.562±0.120)患者(t≤3.082，P<0.003)，IL-10表達(dá)(8.001±1.171)明顯高于療效較差組(7.255±1.125)pg/ml(t≤2.509，P<0.015)。ROC曲線繪制發(fā)現(xiàn)miR-27與IL-10曲線下面積分別為0.719與0.685，存在預(yù)測價值，見表1、圖3。

圖3 治療前miR-27與IL-10表達(dá)在臨床療效中的預(yù)測價值Fig.3 Predictive values of miR-27 and IL-10 expressions in clinical efficacy before treatmentNote:*.P<0.05，**.P<0.01.

表1 ROC參數(shù)(%)Tab.1 ROC parameters(%)

2.4miR-27與IL-10在患者生存中的價值 通過對60例患者進(jìn)行為期3年的隨訪，存活患者為30例，3年存活率為50%，根據(jù)miR-27與IL-10中位值將其分為高、低表達(dá)組，比較miR-27與IL-10高、低表達(dá)組患者生存情況發(fā)現(xiàn)，miR-27低表達(dá)組患者3年存活率明顯高于高表達(dá)組患者，而IL-10低表達(dá)患者3年生存率明顯低于高表達(dá)組患者(P<0.05)，見圖4。

圖4 miR-27與IL-10高、低表達(dá)與患者3年生存情況的關(guān)系Fig.4 Relationship between high and low expressions of miR-27 and IL-10 and survival of patients in 3 yearsNote:A.Total survival rate of patients in 3 years;B.Survival rate of patients in miR-27 high and low expression groups in 3 years;C.Survival rate of patients of IL-10 in high and low expression group in 3 years.

3 討論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤，在2012年全球新增患者約168萬例，而死亡患者超過52萬人，并且有向年輕化發(fā)展的趨勢，嚴(yán)重威脅人們的生命健康與生活質(zhì)量[12]。臨床上關(guān)于乳腺癌的治療方案主要以手術(shù)為主，但乳腺癌發(fā)病初期較為隱匿，入院治療基本已進(jìn)入中晚期，錯過了最佳治療時機(jī)，因此化療就成為這類患者治療的首選方案[13]。雖然患者通過化療后可顯著改善病情，但臨床上關(guān)于乳腺癌化療后的療效預(yù)測指標(biāo)較少[14]。若能提前通過檢測相關(guān)指標(biāo)來判定患者預(yù)后情況，勢必可以更好地改善患者病情。

miRNA是一類長約19-22 nt的非編碼短鏈RNA，具有高度保守性，可通過完全或不完全互補(bǔ)配對的方式與靶基因3′-UTRs結(jié)合，參與靶基因調(diào)控，研究顯示，miRNA與腫瘤及心血管疾病等密切相關(guān)[15,16]。miR-27是miR家族中的重要成員，也稱為miR-27a，位于染色體19p13.12，Tang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27可作為乳腺癌進(jìn)展和患者生存的預(yù)后標(biāo)志物。IL-10是一類多功能的細(xì)胞因子，對細(xì)胞的生長分化起調(diào)節(jié)作用，并參與炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)[18]。Ahmad等[19]研究發(fā)現(xiàn)IL-10與浸潤性乳腺癌患者的良好預(yù)后相關(guān)，但miR-27與IL-10能否作為晚期乳腺癌患者化療療效的潛在預(yù)測指標(biāo)目前尚未明確。本研究通過探究miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者中的表達(dá)及療效預(yù)測價值，為臨床醫(yī)生提供潛在觀察指標(biāo)。

本研究首先檢測了患者血清中miR-27與IL-10的表達(dá)。組織樣本收集對患者存在入侵性傷害，而本研究通過檢測患者血清中目的基因表達(dá)，對患者損傷較小。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組患者血清中miR-27表達(dá)明顯高于對照組，而IL-10的表達(dá)明顯低于對照組，提示miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者中存在差異表達(dá)，與既往的研究結(jié)果相符[20，21]。進(jìn)一步檢測了患者化療后miR-27與IL-10的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，患者治療后miR-27表達(dá)明顯降低，IL-10的表達(dá)明顯升高，提示miR-27與IL-10有望成為乳腺癌化療后的潛在觀察指標(biāo)。推測其機(jī)制可能是由于化療提升了miR-27表達(dá)，從而靶向調(diào)節(jié)IL-10表達(dá)，但具體原因尚不明確[22]。

課題組根據(jù)患者治療后的臨床療效分組進(jìn)一步觀察療效優(yōu)秀組患者與療效較差組患者治療前血清中miR-27及IL-10表達(dá)發(fā)現(xiàn)，療效優(yōu)秀組患者治療前miR-27表達(dá)明顯低于療效較差組，而IL-10與其相反，說明miR-27和IL-10可能成為乳腺癌患者化療后療效的觀察指標(biāo)。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-27與IL-10曲線下面積分別為0.719、0.685，提示化療前通過觀察miR-27與IL-10的表達(dá)對療效預(yù)測存在一定價值。隨訪結(jié)果顯示患者3年生存率為50%，與國內(nèi)文獻(xiàn)結(jié)果相符[23]。根據(jù)患者治療后兩指標(biāo)中位值將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組觀察各組生存情況發(fā)現(xiàn)，miR-27低表達(dá)組與IL-10高表達(dá)組患者生存率明顯高于其對應(yīng)組，提示通過觀察化療后乳腺癌患者miR-27與IL-10的表達(dá)水平對評估患者生存情況存在一定價值。

本研究還存在一定的局限性，首先，作為臨床研究，關(guān)于化療后miR-27與IL-10表達(dá)發(fā)生變化的機(jī)制尚不清楚；其次，miR-27與IL-10雖然對化療后臨床療效預(yù)測價值具有較高的敏感度，但其特異度較低，是否能通過聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物提升特異度目前尚不明確；最后，由于樣本及時間原因，并未進(jìn)行5年甚至更長時間的隨訪，課題組將在今后的研究中開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合更多臨床指標(biāo)，延長隨訪時間，補(bǔ)充本次研究結(jié)果。

綜上所述，晚期乳腺癌患者治療前后的miR-27與IL-10可作為晚期乳腺癌患臨床療效與生存的觀察指標(biāo)。