王紅山 解寒冰 余江濤

(鄭州人民醫(yī)院普通外科,鄭州 450000)

隨著生活水平的提高，胃癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，雖然醫(yī)療水平不斷提高，但胃癌的死亡率仍居高不下，對(duì)患者的健康造成嚴(yán)重威脅。除手術(shù)治療、放化療等傳統(tǒng)療法外，分子靶向治療逐漸受到重視。胃癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病過程中伴隨癌基因的激活或抑癌基因的失活，以及各組信號(hào)通路的紊亂。TBX3是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可通過Wnt等信號(hào)通路發(fā)揮作用[1]。TBX3在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，扮演癌基因角色，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。TBX3可通過Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用，Wnt信號(hào)通路在胃癌的增殖、侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要作用[3，4]。因此本文對(duì)胃癌細(xì)胞中TBX3表達(dá)及沉默TBX3表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討TBX3在胃癌中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 胃癌細(xì)胞系MGC-803、正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2試劑和儀器 Lipofectamine 2000試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)，TBX3 siRNA及陰性對(duì)照siRNA(德國(guó)Qigen公司)，TBX3的shRNA引物序列：F：5′-CCGGGCTGATGACTGTCGTTATAAACTCGAGTTTATAACGACAGTCATCAGCTTTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAGCTGATGACTGTCGTTATAAACTCG-AGTTTATAACGACAGTCATCAGC-3′，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、Trizol試劑、結(jié)晶紫、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，CCK8試劑、Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)BPB公司)，兔抗人TBX3單克隆抗體、兔抗人神經(jīng)-鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體、兔抗人上皮-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人Wnt3α單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人C-myc單克隆抗體(美國(guó)Invitrogen公司)。Transwell小室(美國(guó)TaKaRa公司)，酶標(biāo)儀及流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Gibco公司)等。

1.2方法

1.2.1Western blot檢測(cè)MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中TBX3蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000 g 離心15 min，取上清，Bradford法測(cè)定MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞蛋白濃度，取30 μg蛋白加入SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉，加入兔抗人TBX3單克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜，加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，經(jīng)顯影、曝光、掃描圖像，Image J分析蛋白條帶灰度值。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參。TBX3蛋白水平以TBX3蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.2RT-PCR測(cè)定MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中TBX3 mRNA水平 取MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞細(xì)胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法測(cè)定TBX3 mRNA水平TBX3 F：5′-TTTGAAGACCATGGAGCCCG-3′，R：5′-ACATTCGCCTTCCCGACTTG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。以β-actin為內(nèi)參。TBX3 mRNA水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.3細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MGC-803細(xì)胞分為空白對(duì)照組(BC組)、陰性對(duì)照組(NC組)、siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組，接種于6孔板(5×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行。NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，siR-TBX3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TBX3-siRNAsiR-TBX3+XAV939，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TBX3-siRNA的同時(shí)加入Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939(4 μmol/L)，BC組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染[5]。轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot和RT-PCR測(cè)定細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平，方法同1.2.1和1.2.2。

1.2.4CCK8測(cè)定MGC-803細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h 后各組MGC-803細(xì)胞接種于96孔板(1×103個(gè)/孔)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h加入10 μl CCK8，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，加入CCK8后培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移能力 將轉(zhuǎn)染48 h后的MGC-803細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，稀釋至5×105個(gè)/ml，取200 μl加入Transwell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h取出小室，多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色30 min，鏡下拍照計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前用100 μl Matrigel膠包被小室上室，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6Western blot檢測(cè)MGC-803細(xì)胞N-cadherin、E-cadherin、Snail、Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染48 h MGC-803細(xì)胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，Western blot測(cè)定MGC-803細(xì)胞各蛋白水平。方法同1.2.1。

2 結(jié)果

2.1胃癌細(xì)胞MGC-803中TBX3表達(dá)情況 胃癌細(xì)胞MGC-803中TBX3蛋白和mRNA水平高于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 Western blot測(cè)定 MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中TBX3蛋白水平Fig.1 Western blot analysis of TBX3 protein levels in MGC-803 cells and GES-1 cells

表1 MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中TBX3蛋白及mRNA水平Tab.1 TBX3 protein and mRNA levels in MGC-803 cells and GES-1

2.2轉(zhuǎn)染后各組MGC-803細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組MGC-803細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

圖2 Western blot測(cè)定MGC-803細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中TBX3蛋白水平Fig.2 Western blot analysis of TBX3 protein levels in MGC-803 cells and GES-1 cells

表2 各組MGC-803細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平Tab.2 TBX3 protein and mRNA levels in each group of MGC-803

2.3各組MGC-803細(xì)胞增殖能力比較 24 h時(shí)，各組MGC-803細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；42、72 h時(shí)，與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組MGC-803細(xì)胞增殖能力Fig.3 Proliferation ability of each group of MGC-803 cellsNote:Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.4各組MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較Fig.4 Comparison of number of invasion and migration cells of each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.5各組MGC-803細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞N-cadherin、Snail蛋白水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)；與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞N-cadherin、Snail蛋白水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細(xì)胞N-cadherin、E-cadherin、Snail蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 Western blot測(cè)定各組MGC-803細(xì)胞N-cadherin、E-cadherin、Snail蛋白水平Fig.5 Western blot analysis of N-cadherin,E-cadherin and Snail protein levels in each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.6各組MGC-803細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平降低(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 Western blot測(cè)定各組MGC-803細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平Fig.6 Western blot analysis of Wnt3α，β-catenin and C-myc protein levels in each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

3 討論

T-box基因在多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可通過與DNA結(jié)合參與并調(diào)節(jié)胚胎組織和形態(tài)發(fā)育。TBX3是T-box家族成員之一，在胚胎發(fā)育、肝細(xì)胞和惡性腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用，TBX3缺失可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化，可通過Wnt 信號(hào)通路調(diào)控肝細(xì)胞分化，TBX3通過對(duì)胚胎干細(xì)胞的調(diào)控作用促進(jìn)肝臟、心臟、四肢及乳腺等發(fā)育[6]。TBX3在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[7]。如TBX3參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可促進(jìn)非侵襲性乳腺癌向浸潤(rùn)性乳腺癌進(jìn)展，在腎癌組織中高表達(dá)，與腎癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，參與腎癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后不良有關(guān)[8-11]。本文對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中TBX3水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)胃癌MGC-803細(xì)胞中TBX3蛋白和mRNA水平升高，沉默TBX3表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，表明TBX3可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可提高惡性腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞形成，降解細(xì)胞外基質(zhì)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，賦予惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移潛能[12,13]。N-cadherin為間質(zhì)性蛋白，E-cadherin為上皮標(biāo)志蛋白，N-cadherin表達(dá)水平升高的同時(shí)E-cadherin表達(dá)下降或缺失為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[14,15]。Snail為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的重要轉(zhuǎn)錄因子，可抑制E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄，降低細(xì)胞間的黏附作用，從而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默胃癌細(xì)胞中TBX3可降低細(xì)胞中N-cadherin、Snail蛋白水平，上調(diào)細(xì)胞中E-cadherin蛋白水平。表明沉默TBX3可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路為惡性腫瘤增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵通路，在胃癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制該信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[17]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)閉時(shí)，β-catenin與絲蘇氨酸蛋白激酶3、腺瘤結(jié)腸息肉蛋白和軸蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子形成降解復(fù)合物，通過誘導(dǎo)β-catenin泛素化修飾終止信號(hào)通路傳導(dǎo)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，β-catenin大量累積并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動(dòng)下游C-myc、CyclinD1等靶基因轉(zhuǎn)錄，并調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)胃癌的增殖和侵襲遷移過程[18-20]。C-myc和腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，可促進(jìn)細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖。TBX3可通過Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用，在S期發(fā)揮重要作用，通過C-myc調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)過程[21]。本文沉默胃癌細(xì)胞TBX3表達(dá)，可抑制細(xì)胞中Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平；給予Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑也可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移，并降低細(xì)胞中N-cadherin、Snail、Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平，升高細(xì)胞中E-cadherin蛋白水平，提示沉默細(xì)胞TBX3及給予Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑均可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，表明沉默TBX3可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移。

綜上所述，胃癌MGC-803細(xì)胞中TBX3水平升高，沉默TBX3可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲遷移，有望成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。