段金旗 林 艷

(張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)院，張家口 075000)

目前，膿毒癥發(fā)病率、病死率居高不下，臨床救治十分困難，是當(dāng)今重癥醫(yī)學(xué)所面臨的難題[1]。姜黃素具有抗腫瘤、清除自由基、抗氧化、抗炎等藥理作用，在多種疾病的治療方面有廣闊的應(yīng)用前景[2]。許多文獻報道姜黃素對膿毒癥引起的器官損傷有保護作用，但對于膿毒癥引發(fā)的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)療效，目前研究甚少[3]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)建立膿毒癥ALI大鼠模型，觀察大鼠肺組織病理變化，進一步研究姜黃素對膿毒癥ALI中炎癥因子的表達及相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒(武漢博士德公司)；HMGB1抗體(Santa Cruze公司)；RNA 提取試劑(美國 Gibco公司);SYBR Green PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)；HMGB1引物合成(中國北京鼎國生物技術(shù)公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物工程有限公司)；姜黃素和二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma公司)；Real-time PCR檢測儀ABI7900(美國 Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 清潔級，雄性，6～8周齡SD 大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘) 2015-0013，術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。 大鼠隨機分為 3 組(每組10 只)：對照組、模型組及治療組。對照組大鼠在麻醉開腹后立即關(guān)閉腹腔，術(shù)后不給藥。而模型組和治療組均依照文獻[4]采用CLP法建立膿毒癥ALI模型。治療組術(shù)后 2 h 經(jīng)腹腔注射200 mg/kg的姜黃素(0.1% DMSO溶解)，模型組術(shù)后 2 h 經(jīng)腹腔注射0.1 % DMSO (1 ml/kg)。

1.2.2標(biāo)本處理 建模后，將大鼠麻醉腹主動脈采血4 ml ，分離血清，-80℃保存；對肺組織進行灌洗，收集灌洗液，-20℃保存；手術(shù)切取右肺葉于液氮中保存。

1.2.3檢測指標(biāo)

1.2.3.1觀察大鼠生存率 以各組大鼠造模時間為起始點，觀察大鼠存活情況，以天為時間節(jié)點，共觀察7 d。

1.2.3.2HE染色觀察肺組織病理變化 將切除的右肺上葉組織固定于4%多聚甲醛中24 h，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，制備5 μm石蠟切片。脫蠟后，HE染色，于光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察組織病理學(xué)變化，并采集圖像。

1.2.3.3電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化 取右肺上葉組織，2.5%戊二醛預(yù)固定后，梯度乙醇脫水，無水丙酮/包埋劑滲透，包埋、超薄切片，采用電子透射電鏡觀察并對比各組血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞等超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3.4ELISA法檢測血清和BALF中TNF-α、IL-6含量 大鼠腹腔麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，備用。并取左肺用預(yù)冷的生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，共3次，收集BALF，于4℃離心收集上清液。測定BALF及血清中TNF-α、IL-6水平。具體方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3.5qRT-PCR法檢測肺組織HMGB1 mRNA表達 取肺臟組織，TRIzol法提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，HMGB1、GAPDH引物序列由北京鼎國生物技術(shù)公司合成，再以反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA為模板配成20 μl反應(yīng)體系，在Real-time PCR儀上設(shè)定擴增參數(shù)，檢測樣品中HMGB1和GAPDH內(nèi)參基因Ct值，重復(fù)3次，表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3.6Western blot檢測肺組織HMGB1蛋白表達 在液氮中將肺組織充分研磨，采用蛋白裂解液(RIPA)裂解，均漿后使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配平各組蛋白濃度后，加熱變性，進行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉30 min，加入HMGB1抗體4℃過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。以HMGB1與β-actin的灰度值比值作為HMGB1蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠生存率 如圖1所示，治療組7 d生存率高于模型組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠存活率比較Fig.1 Survival rate comparison of each group of ratsNote:*.P<0.05.

2.2HE染色觀察大鼠肺組織病理變化 對照組未見病理改變；模型組水腫明顯，肺泡及間質(zhì)出現(xiàn)炎癥、出血，肺損傷逐漸加重，48 h后損傷到達高峰；治療組24 h后損傷到達高峰，48 h時肺損傷程度明顯減輕，見圖2。

圖2 各組肺組織病理變化(×200)Fig.2 Pathological changes of lung tissue in each group(×200)

2.3電鏡觀察各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化 對照組肺泡毛細血管膜及肺泡上皮形態(tài)、數(shù)量基本正常，細胞連接緊密；模型組在6、12 h時肺泡上皮細胞數(shù)量下降，細胞器減少，連接顯疏松，在24、48 h時肺泡毛細血管內(nèi)皮脫落，胞漿出現(xiàn)渾濁，細胞連接疏松；治療組在各時間點受損程度均較模型組輕，見圖3。

圖3 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Ultra-structural changes of lung tissue in each groupNote:Length of scale=1 μm.

2.4qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA表達 對照組大鼠各時間點肺組織HMGB1 mRNA表達明顯低于模型組或治療組(P<0.05)；與模型組相比，治療組在12、24、48 h時HMGB1 mRNA表達明顯下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 不同時間各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA表達Fig.4 Expression of HMGB1 mRNA in lung tissue of rats at different timeNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

2.5Western blot檢測各組大鼠肺組織HMGB1蛋白表達 對照組大鼠各時間點肺組織HMGB1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且低于模型組或治療組；與模型組相比，治療組各時間點HMGB1蛋白表達明顯下降(P<0.05)，見圖5。

圖5 大鼠肺組織HMGB1蛋白表達Fig.5 Expression of HMGB1 in rat lung tissueNote:1.Control group;2.Model group 6 h;3.Model group 12 h;4.Model group 24 h;5.Model group 48 h;6.Treatment group 6 h;7.Treatment group 12 h;8.Treatment group 24 h;9.Treatment group 48 h.

2.6ELISA法檢測大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-6含量變化 大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-6含量變化情況相似。在不同時間點，對照組TNF-α和IL-6含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯低于模型組或治療組；與模型組相比，治療組大鼠在24、48 h時血清和BALF中TNF-α和IL-6含量明顯下降(P<0.05)，見圖6。

圖6 大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6含量變化Fig.6 Changes of TNF-α and IL-6 in serum and BALF of ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

膿毒癥最新定義為宿主對感染引起失控反應(yīng)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙綜合征，具有30%～70%的病死率，是重癥患者死亡的重要原因之一[5-7]。姜黃素是姜科植物根莖中提取的天然黃色多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)為雙阿魏酰甲烷，因其提取工藝簡單、安全、廉價，且具有抗腫瘤、抗淀粉樣蛋白、抗菌、抗氧化、抗炎等作用，而逐漸成為醫(yī)學(xué)界的一個研究熱點[8]。文獻報道，姜黃素對細菌或注入內(nèi)毒素引發(fā)的膿毒癥動物模型組織器官具有保護作用[9]。膿毒癥是引發(fā)ALI最重要的危險因素之一，目前還缺乏有效治療手段，而有關(guān)姜黃素對膿毒癥ALI方面的報道更少。CLP法建立膿毒癥ALI模型是目前公認與臨床相關(guān)性較高的建模方法，本研究采用此模型探索姜黃素對膿毒癥ALI中炎癥因子的調(diào)節(jié)作用機制。

大鼠生存率結(jié)果顯示，治療組7 d生存率高于模型組，說明姜黃素能改善大鼠7 d生存率。生存率研究還發(fā)現(xiàn)，模型組在48 h時死亡率為40%明顯高于治療組，這提示及早干預(yù)治療膿毒癥性ALI對提高生存率有重要作用；HE染色結(jié)果顯示，對照組未見病理改變，模型組水腫明顯，肺損傷隨時間延長逐漸加重，而治療組各時間點損傷程度較模型組減輕，說明姜黃素能減輕肺損傷炎癥程度，這一結(jié)論在電鏡觀察結(jié)果中也得到證實。

TNF-α主要由激活的淋巴細胞、單核/巨噬細胞等分泌，它能直接介導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡和壞死，促進微血栓形成，誘導(dǎo)其他細胞因子如IL-1、IL-6等的產(chǎn)生[10]。IL-6 是一種多功能的細胞因子，能刺激造血干細胞的生長和增加急性相蛋白的合成，還能激活 T、B 淋巴細胞的免疫反應(yīng)而調(diào)節(jié)機體免疫[11]。還有許多文獻報道，IL-6具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，是 TNF-α和 IL-1β的反調(diào)控/抗炎因子[12]。ELISA檢測結(jié)果顯示，在不同時間點，對照組中TNF-α、IL-6含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與模型組相比，治療組在24、48 h時大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6含量明顯下降(P<0.05)，說明經(jīng)姜黃素治療后能降低肺組織炎癥浸潤程度，血清和BALF中TNF-α、IL-6水平較模型組降低，有利于防止過度炎癥造成的肺損傷，提示姜黃素對膿毒癥ALI大鼠具有保護作用。

HMGB1是一種非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)以及炎癥反應(yīng)等[13]。以往研究證實HMGB1 能直接導(dǎo)致ALI，表現(xiàn)為炎癥細胞因子釋放增加、損傷肺實質(zhì)細胞、肺泡充血和肺出血等[14]。TLR4能特異性地識別病原相關(guān)分子模式，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，介導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL6等表達，引起相應(yīng)炎癥介質(zhì)合成和釋放[15]。近年來大量研究結(jié)果還證實，HMGB1是TLR4的重要的內(nèi)源性配體，如果抑制TLR4的功能，不僅有利于膿毒癥ALI抗炎作用，還能發(fā)揮抗膿毒癥作用，提示TLR4參與了膿毒癥ALI發(fā)病過程，干預(yù)TLR4可能會成為治療膿毒癥的新途徑[16]。研究中qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組在各時間點HMGB1 mRNA和蛋白表達明顯上升，經(jīng)姜黃素治療后HMGB1 mRNA和蛋白表達下降，說明HMGB1可能在不同水平參與膿毒癥ALI的發(fā)展，而姜黃素能夠抑制HMGB1的表達，可能下調(diào)TLR4進而降低肺部TNF-α、IL-6表達。

綜上所述，姜黃素可以在膿毒癥ALI大鼠中發(fā)揮治療作用，但實驗仍存在幾個問題：首先，膿毒癥ALI大鼠模型不能完全反映人類膿毒癥ALI發(fā)病；其次，本研究評估了姜黃素對模型組大鼠存活率的短期影響，而不是長期效果。因此還需要進一步長期研究姜黃素對膿毒癥ALI的保護作用。