文蘭香 覃世運(yùn) 陳麗君

(海南省第三人民醫(yī)院腫瘤中心，三亞 572000)

肺癌是發(fā)生于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居男性惡性腫瘤的首位，近年來(lái)在女性中發(fā)病率也迅速提高，嚴(yán)重危害人類生命健康[1,2]。臨床上主要通過(guò)外科手術(shù)以及化療治療肺癌，但持續(xù)使用化療藥物會(huì)造成骨髓抑制，且易產(chǎn)生耐藥性[3]。中藥因具有保護(hù)骨髓、毒性較小等優(yōu)勢(shì)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)一定地位，因此尋求毒副作用小、肺癌治療效果顯著的中醫(yī)藥物質(zhì)成為研究重點(diǎn)之一[4]。槲皮素是在植物中廣泛存在的黃酮類物質(zhì)，研究顯示其可能通過(guò)影響癌細(xì)胞自噬，在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用[5,6]。自噬是真核細(xì)胞中存在的生理現(xiàn)象，是蛋白降解的一種途徑，對(duì)維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定十分重要，大量研究顯示自噬作用與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[7]。但槲皮素對(duì)肺部腫瘤的作用研究較少，因此本研究初步探討槲皮素對(duì)肺癌A549細(xì)胞自噬的影響以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物 槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(純度≥98%)，用0.05 mol/L的NaOH溶液配制成1 mmol/L槲皮素母液，過(guò)濾除菌后保存?zhèn)溆茫褂们坝煤?0% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.1.3試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰酶購(gòu)自Thermo Hyclone公司；CCK-8相關(guān)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自北京全式金生物公司；鼠抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K、GAPDH一抗購(gòu)及二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)染色試劑盒購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存A549細(xì)胞系快速解凍后，添加PBS洗滌，置于離心機(jī)內(nèi)3 000 r/min離心10 min 棄上清，添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基4 ml，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，去上清，PBS洗滌細(xì)胞，0.2%胰酶消化后加入培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，3代后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。次日進(jìn)行分組，分為空白對(duì)照組：含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液；槲皮素組：低、中、高劑量組分別加入終濃度為100、150、200 μmol/L槲皮素溶液。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)槲皮素對(duì)A549增殖的影響 取1.2.2中各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組-A空白孔)/(A未處理組-A空白孔)]×100%。

1.2.4MDC染色法檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響 取1.2.2中各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后按照MDC染色試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm)，計(jì)數(shù)并拍照。檢測(cè)到高亮點(diǎn)狀熒光代表自噬泡。

1.2.5Western blot檢測(cè)自噬及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2.2中各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后，添加(1∶500)鼠抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K一抗，以GAPDH為內(nèi)參，4℃過(guò)夜后，添加二抗稀釋液孵育2 h，ECL顯色后，于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)并保存圖像。

1.2.6AMPK抑制劑對(duì)自噬的影響 收集1.2.1中細(xì)胞，加入10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C預(yù)孵育2 h后，加入200 μmol/L槲皮素。根據(jù)1.2.4中方法檢測(cè)細(xì)胞自噬形態(tài)變化，根據(jù)1.2.5中方法檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1蛋白及通路AMPK/mTOR相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制影響 CCK8檢測(cè)顯示，與空白對(duì)照組比較，檢測(cè)濃度范圍內(nèi)隨著槲皮素濃度的增加(100、150、200 μmol/L)，對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)。與作用24 h相比，作用48、72 h細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，作用48 h與72 h細(xì)胞增殖抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制的影響Tab.1 Effect of quercetin on proliferation inhibition of A549

2.2不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響 MDC染色顯示，空白對(duì)照組中僅有A549少量細(xì)胞檢測(cè)到高亮點(diǎn)狀熒光，槲皮素作用48 h后，槲皮素組A549細(xì)胞中各劑量組檢測(cè)到高亮點(diǎn)狀熒光的自噬泡數(shù)量依次增多。見圖1。

圖1 不同濃度槲皮素對(duì)A549自噬的影響(×400)Fig.1 Effects of quercetin at different concentrations on autophagy of A549 (×400)Note:A.Blank control group;B.Quercetin low dose group;C.Quercetin medium dose group;D.Quercetin high dose group.

2.3不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響 作用48 h后，與空白對(duì)照組相比，槲皮素組各劑量A549細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1表達(dá)依次升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響Tab.2 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of autophagy-related proteins in A549

圖2 不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of autophagy-related proteins in A549 cellsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

2.4不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與空白對(duì)照組相比，槲皮素組各劑量A549細(xì)胞中p-AMPK/AMPK水平依次增加(P<0.05)，p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響Tab.3 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of AMPK/mTOR pathway related proteins in A549

圖3 不同濃度槲皮素對(duì)A549細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effects of quercetin at different concentrations on expression of AMPK/mTOR pathway-related proteins in A549 cellsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

2.5AMPK抑制劑對(duì)A549細(xì)胞自噬及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1AMPK抑制劑對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示，與槲皮素組相比，槲皮素+AMPK抑制劑組A549細(xì)胞中高亮點(diǎn)狀熒光的自噬泡數(shù)量減少。見圖4。

圖4 AMPK抑制劑對(duì)細(xì)胞自噬影響(×400)Fig.4 Effects of AMPK inhibitors on autophagy (×400)Note:A.Blank control group;B.Quercetin low dose group;C.Quercetin medium dose group;D.Quercetin high dose group.

2.5.2AMPK抑制劑對(duì)自噬相關(guān)蛋白及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白影響 與槲皮素組相比， 槲皮素+AMPK抑制劑組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K表達(dá)升高(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 AMPK抑制劑對(duì)自噬相關(guān)蛋白及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白影響Tab.4 Effects of AMPK inhibitors on autophagy-related proteins and AMPK/mTOR pathway-related

圖5 AMPK抑制劑對(duì)自噬相關(guān)蛋白及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白影響Fig.5 Effects of AMPK inhibitors on autophagy-related proteins and AMPK/mTOR pathway-related proteinsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

3 討論

槲皮素是常見的黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于植物花、莖、葉、果實(shí)中，多以甙的形式存在，化學(xué)分子式為C15H10O7，在止咳、平喘、降壓等方面具有重要作用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，其具有阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞傳導(dǎo)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，并對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌有較好的抑制作用[9,10]。本研究顯示經(jīng)槲皮素處理肺癌A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，且呈劑量依賴性，提示槲皮素可抑制A549細(xì)胞增殖。

研究顯示，槲皮素可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬產(chǎn)生抗腫瘤作用，其與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11，12]。自噬是吞噬自身蛋白質(zhì)進(jìn)入囊泡并依賴溶酶體降解包裹內(nèi)容物的過(guò)程，在機(jī)體正常生理及病理過(guò)程中均有顯示[12]?？鼓[瘤藥物常通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或自噬發(fā)揮治療作用[13]。Du等[14]研究表明，槲皮素通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素組A549細(xì)胞中檢測(cè)到高亮點(diǎn)狀熒光的自噬泡數(shù)量隨濃度升高而增多，提示槲皮素可促進(jìn)A549細(xì)胞自噬。LC3是自噬過(guò)程中標(biāo)志蛋白，外源物質(zhì)刺激細(xì)胞自噬啟動(dòng)時(shí)，胞漿型的LC3Ⅰ分解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，參與自噬體膜形成[15]。beclin-1是形成自噬體的必要分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡，并調(diào)控自噬體的形成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理后，A549細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)以及beclin-1水平明顯上調(diào)，提示槲皮素可促進(jìn)A549細(xì)胞中有自噬體膜及吞噬泡形成。

AMPK-mTOR通路在多種疾病中發(fā)揮作用。Long等[17]研究表明，AMPK-mTOR通路與細(xì)胞自噬相關(guān)。細(xì)胞接受外界刺激時(shí)，AMP/ATP水平升高，使AMPK活化，增強(qiáng)對(duì)AMPK下游mTOR蛋白功能的抑制作用，而mTOR是自噬發(fā)生發(fā)展的中心蛋白，可調(diào)節(jié)下游底物S6K磷酸化，抑制細(xì)胞自噬[18,19]。肖潔等[20]研究表明，槲皮素通過(guò)激活該通路誘導(dǎo)急性髓系白血病HL-60細(xì)胞自噬。因此本研究對(duì)AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)槲皮素處理后，A549細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平劑量依賴性增加，mTOR蛋白磷酸化水平劑量依賴性降低，S6K蛋白磷酸化水平降低，提示槲皮素可能促進(jìn)AMPK-mTOR通路活化。進(jìn)一步研究顯示，添加AMPK特異性抑制劑Compound C后，A549細(xì)胞中高亮點(diǎn)狀熒光的自噬泡減少，同時(shí)細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平降低，下游mTOR、S6K磷酸化水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及beclin-1蛋白表達(dá)減少，提示槲皮素可能通過(guò)促進(jìn)AMPK-mTOR信號(hào)通路的激活，促進(jìn)A549細(xì)胞自噬發(fā)生。

綜上所述，槲皮素可能通過(guò)激活A(yù)MPK-mTOR通路，促進(jìn)人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬，本研究為槲皮素治療肺癌提供一定理論基礎(chǔ)。但本研究也存在一定不足，何種自噬基因啟動(dòng)誘發(fā)自噬有待深入探討。