曹 干 王寧萍 崔振華 王佩佩 楊勇婭 張艷麗

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，銀川 750004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是慢性、進(jìn)行性、侵蝕性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征，其發(fā)病機(jī)制通常認(rèn)為與CD4+T淋巴細(xì)胞分化異常有關(guān)。濾泡輔助性T(T follicular helper，Tfh)細(xì)胞是可促進(jìn)淋巴濾泡生發(fā)中心形成、輔助B細(xì)胞活化、增殖、分化并產(chǎn)生高親和力抗體的CD4+T細(xì)胞，研究提示Tfh細(xì)胞在RA的炎癥形成、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞、骨侵蝕中具有重要作用[1，2]。RA治療多使用非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素，但僅能緩解癥狀且副作用較多。生物制劑治療逐漸被關(guān)注，已取得一定療效，如英夫利昔單抗(Infliximab)，但價(jià)格昂貴。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)從寧夏道地藥材苦豆子中提取的氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)在小鼠體內(nèi)顯示了較好的抗炎作用，可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡起抗RA作用，但作用機(jī)制尚不明確[3，4]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建DBA/1J小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，明確OMT治療效果，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只雄性SPF級(jí)DBA/1J小鼠購自卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(No.201708981)，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g。飼養(yǎng)于我院動(dòng)物室潔凈柜，室溫20～25℃，相對(duì)濕度55%，自由飲食。DBA/1J小鼠隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、地塞米松組、OMT高、中、低劑量組，每組7只。實(shí)驗(yàn)中意外死亡的小鼠或造模未成功的小鼠用同批次其余8只小鼠做相應(yīng)補(bǔ)充。

1.1.2藥物 OMT(批號(hào)：20161028)購自寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司，純度99.18%；地塞米松注射液[5 mg/(2 ml·支)]購自山東辰欣藥業(yè)集團(tuán)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]確定本實(shí)驗(yàn)OMT高劑量組(OMT-H)OMT濃度為180.0 mg/(kg·d)，中劑量組(OMT-M)為90.0 mg/(kg·d)，低劑量組(OMT-L)為45.0 mg/(kg·d)。用生理鹽水溶解OMT并過濾，4℃保存待用。

1.1.3試劑 牛源性Ⅱ型膠原購自Chondrex公司；完全及不完全弗氏佐劑購自Sigma公司；Percpcy5.5標(biāo)記的Anti-mouse-CD4、FITC標(biāo)記的Anti-mouse-CXCR5、PE標(biāo)記的Anti-mouse-ICOS購自BD公司；小鼠IL-21 ELISA試劑盒購自欣博盛公司；小鼠血清Ⅱ型膠原抗體(CⅡ-Ab)ELISA試劑盒購自上海寶曼生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1建模 將2.0 mg/ml的牛源性Ⅱ型膠原和等體積完全弗氏佐劑混合并完全乳化后，皮下多點(diǎn)注射于各組小鼠背部近尾1～2 cm處，0.1 ml/只，正常組注射等體積生理鹽水，21 d后同法加強(qiáng)免疫。造模后第15天，陽性藥物組腹腔注射地塞米松，2.8 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周，1周后以1.4 mg/kg 劑量維持；OMT高、中、低劑量組依照方案分別行腹腔注射；正常組及模型組腹腔注射等體積生理鹽水。治療30 d后于第45天依據(jù)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定處死全部小鼠。

1.2.2觀測(cè)CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹度 每隔3 d由專人使用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄各組小鼠右爪和右踝關(guān)節(jié)厚度，連續(xù)測(cè)量至第45天，計(jì)算CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度(mm2)=右爪腫脹(mm)×右踝腫脹(mm)。

1.2.3評(píng)估CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI) 小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行分級(jí)，每只足爪關(guān)節(jié)的評(píng)分最高為4分：0分為正常，無紅腫跡象；1分為1個(gè)或多個(gè)小趾關(guān)節(jié)輕微紅腫；2分為足跖和趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹；3分為小鼠踝關(guān)節(jié)及以下足爪出現(xiàn)紅腫；4分為小鼠整個(gè)足爪以及踝關(guān)節(jié)腫脹，最高分?jǐn)?shù)為16分。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾Tfh細(xì)胞比例 各組小鼠脫頸處死后無菌摘取脾臟并采用淋巴細(xì)胞分離液制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/50 μl。避光加入Percpcy5.5標(biāo)記的Anti-mouse-CD4、FITC標(biāo)記的Anti-mouse-CXCR5、PE標(biāo)記的Anti-mouse-ICOS抗體，同時(shí)設(shè)空白細(xì)胞管和單抗體標(biāo)記管，錫紙包裹置4℃冰箱孵育30 min。洗滌2次后用300 μl PBS混勻重懸細(xì)胞。300目濾膜過濾后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，F(xiàn)lowjo7.6.5軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5HE染色法觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)組織情況 取小鼠右后肢關(guān)節(jié)制作蠟塊，切成4 μm薄片行HE染色，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab含量 小鼠摘眼球取血，離心取血清，按ELISA試劑盒內(nèi)說明書檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1OMT緩解CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀 治療21 d后OMT高、中劑量組小鼠關(guān)節(jié)紅腫情況緩解，細(xì)胞排列較規(guī)則且增生情況減輕、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少、滑膜層數(shù)變薄，OMT低劑量組未見明顯改善，地塞米松組有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)(×100)Fig.1 Arthritis in CIA mice(×100)Note:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.

2.2OMT緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹度并降低AI 地塞米松組、OMT高劑量組小鼠在首次免疫后第32天關(guān)節(jié)腫脹明顯緩解，治療3周后，地塞米松組、OMT高、中、低劑量組小鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯緩解。模型組小鼠AI隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，第25天時(shí)達(dá)到高峰，后隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分Fig.2 Joint swelling degree and arthritis index score of CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

2.3OMT降低CIA小鼠脾Tfh細(xì)胞比例 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞百分比結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.01)，地塞米松組、OMT高、中劑量組CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞百分比顯著下降(P<0.01，圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh細(xì)胞百分比Fig.3 Flow cytometry was used to detect percentage of spleen CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh cells

2.4OMT抑制CIA小鼠血清IL-21、CⅡ-Ab表達(dá) 與正常組相比模型組CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表達(dá)顯著升高(P<0.01)，OMT治療30 d后，地塞米松組、OMT高、中劑量組小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab水平降低(P<0.05)，且地塞米松組下降幅度大于OMT高劑量組，見圖4。

圖4 ELISA檢測(cè)CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表達(dá)Fig.4 ELISA to detect serum IL-21 and CⅡ-Ab expressions in CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

3 討論

Tfh細(xì)胞是位于次級(jí)淋巴組織(secondary lymphoid organs，SLOs)生發(fā)中心的可輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的CD4+T細(xì)胞，其表達(dá)的特征性膜表面分子主要包括：趨化性細(xì)胞因子受體(CXC chemokine receptor 5,CXCR5+)、誘導(dǎo)共刺激分子(inducible costimulatory molecule,ICOS)、程序性細(xì)胞死亡蛋白(programmed cell death protein 1,PD-1)、CD40L等，高表達(dá)鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6(B-cell lymphoma-6)，可分泌IL-21[7，8]。Tfh細(xì)胞通過表達(dá)CXCR5識(shí)別其配體CXCL13并結(jié)合引導(dǎo)Tfh細(xì)胞遷移至淋巴濾泡形成生發(fā)中心。ICOS可與主要表達(dá)于B細(xì)胞的ICOS配體結(jié)合，促進(jìn)Tfh細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-21。IL-21通過與生發(fā)中心B細(xì)胞表面或Tfh細(xì)胞自身表達(dá)的IL-21受體結(jié)合，促進(jìn)漿細(xì)胞分化產(chǎn)生大量抗體并誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞表達(dá)CXCR5并遷移至生發(fā)中心，維持T-B細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡[9]。Bcl-6是初始CD4+T細(xì)胞分化為Tfh細(xì)胞的必要條件，且可誘導(dǎo)CXCR5表達(dá)，缺乏Bcl-6則T細(xì)胞生發(fā)中心無法形成，亦不能分化為Tfh細(xì)胞，影響Th1、Th2、Th17細(xì)胞分化[10]。由于Tfh細(xì)胞對(duì)生發(fā)中心B細(xì)胞的多種生物學(xué)作用，決定其數(shù)量或功能的改變都將引起免疫應(yīng)答紊亂，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)疾病[11]。

RA的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但不同亞群的CD4+T細(xì)胞一直備受關(guān)注[12，13]。研究表明Tfh細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例升高或其功能發(fā)生紊亂參與RA發(fā)生發(fā)展。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)初發(fā)RA患者外周血存在高比例循環(huán)的CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+ICOS+和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞，且RA患者血清高水平IL-21與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。Ma等[15]證實(shí)RA患者與健康志愿者相比，其外周血循環(huán)CD4+CXCR5+ICOShighTfh細(xì)胞增多，并伴隨抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-CCP)水平升高。Jang等[16]構(gòu)建IL-21受體缺陷的K/BxN小鼠RA模型，發(fā)現(xiàn)IL-21水平下降且Tfh細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致RA進(jìn)展減緩。OMT是從寧夏道地中草藥苦豆子中提取的單體堿，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示OMT可緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹、降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)并能調(diào)控Th17細(xì)胞數(shù)量，因此本團(tuán)隊(duì)主要研究OMT能否作用于Tfh細(xì)胞而干預(yù)RA發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過建立CIA小鼠模型觀察Tfh細(xì)胞在RA發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果表明CIA模型組小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞比例增高、血清IL-21水平升高、產(chǎn)生大量CⅡ-Ab，高、中劑量OMT可抑制Tfh細(xì)胞過度增殖和活化，抑制IL-21的高水平分泌及大量抗體的產(chǎn)生，HE染色結(jié)果顯示OMT緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)組織的炎癥病理變化，提示OMT可能對(duì)Tfh細(xì)胞具有調(diào)控作用從而治療RA。但OMT是如何調(diào)控Tfh細(xì)胞表面膜分子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌從而達(dá)到治療RA的免疫學(xué)分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。