劉麗軍 郭倩穎 崔銘萱 劉菊芬 楊晨 李雪寧 柳鵬 王琳琳

母乳成分復(fù)雜，不僅可以滿足嬰兒的營養(yǎng)需求，還可以提供保護(hù)成分，以助于嬰兒腸道發(fā)育和免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟。母乳中有多種免疫調(diào)節(jié)成分，這些成分對于嬰兒建立先天免疫力和發(fā)展適應(yīng)性免疫力至關(guān)重要。另外，它在變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防或發(fā)展中可能也發(fā)揮一定作用[1]。其中，分泌性免疫球蛋白(secretory Immunoglobulin A，sIgA)因含量豐富，功能顯著而備受關(guān)注。當(dāng)病原體進(jìn)入母親的腸道或上呼吸道時，派伊爾氏淋巴結(jié)獲得病原體，其抗原由M細(xì)胞呈遞至循環(huán)的B細(xì)胞，然后再向乳腺上皮細(xì)胞的漿膜側(cè)遷移，并產(chǎn)生IgA。隨著IgA從乳腺上皮細(xì)胞的漿膜側(cè)移至腔(頂)側(cè)，它們被糖基化并復(fù)合形成sIgA，并分泌到母乳中[2]。母乳中的sIgA被認(rèn)為是主要的免疫球蛋白，通過細(xì)胞內(nèi)的中和、病毒排泄和免疫排斥以保護(hù)嬰兒免受病原體和毒素?fù)p害[3]。

母乳中sIgA的濃度可能受早產(chǎn)、感染、妊娠期糖尿病[4-7]等的影響，而這些因素大多與機(jī)體炎癥狀態(tài)有關(guān)。作為炎癥狀態(tài)的重要指標(biāo)，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)已被廣泛用于妊娠期糖尿病、先兆子癇等的病因探討[8-9]。婦女孕早期的NLR水平也可能對母乳中的sIgA產(chǎn)生影響。本研究收集了產(chǎn)婦產(chǎn)后42 d左右的成熟乳，并對哺乳期的膳食情況進(jìn)行調(diào)查，同時，收集孕早期血常規(guī)檢查信息和研究對象一般情況，探討孕早期炎癥狀態(tài)是否會影響成熟乳中的sIgA濃度。

對象與方法

一、對象

本研究以2018年6月至2019年6月在北京大學(xué)人民醫(yī)院生產(chǎn)的婦女為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)在北京大學(xué)人民醫(yī)院接受產(chǎn)前檢查并生產(chǎn)的健康女性；(2)在產(chǎn)后42 d左右來臨床營養(yǎng)科進(jìn)行營養(yǎng)咨詢,當(dāng)日提供母乳且接受問卷調(diào)查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕早期未接受任何檢測；(2)收集的母乳量不夠；(3)產(chǎn)后感染；(4)患有精神心理疾患和艾滋病、乙肝等傳染性疾病。

從募集的母乳庫中，本研究最終獲得具有成熟乳(≥5 ml)的所有研究對象,共計206例，其中204例接受了孕早期血常規(guī)檢測。

本研究已獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均經(jīng)知情同意并簽署書面知情同意書。

二、方法

1.調(diào)查內(nèi)容與方法：產(chǎn)婦知情同意后，從營養(yǎng)門診采集產(chǎn)婦一般情況，包括出生日期、民族、孕前身高、體重、既往史、孕產(chǎn)史、末次月經(jīng)、分娩情況、體力活動情況等。

利用食物頻率調(diào)查問卷(FFQ)[10]調(diào)查產(chǎn)婦哺乳期的膳食習(xí)慣，對所有產(chǎn)婦進(jìn)行從產(chǎn)后第一天到采集母乳當(dāng)日的膳食攝入情況調(diào)查。參考中國食物成分表標(biāo)準(zhǔn)版(第六版)，計算調(diào)查對象每日營養(yǎng)素平均攝入量[11]。

2.生物標(biāo)本采集：產(chǎn)婦來營養(yǎng)科就診當(dāng)天，自行清潔乳房，手法擠乳為主，采集至少50 ml的母乳，將母乳儲存在儲奶袋里。若母乳是前一日的，則需由產(chǎn)婦自行將母乳冷凍后帶到醫(yī)院。

醫(yī)生及工作人員將收集好的母乳貼上標(biāo)簽，準(zhǔn)確記錄分娩日期、病案號和寶寶性別。采奶后入庫待用，冰箱內(nèi)-80℃儲存。

3.實驗室檢測：使用血液分析儀(日本Sysmex公司，XN9000-B2(2))分析孕早期(小于12周)全血NLR，NLR=中性粒細(xì)胞絕對數(shù)/淋巴細(xì)胞絕對數(shù)。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Dogesce公司,DG11718H)檢測母乳中的sIgA。將母乳收集到無菌管中，2℃～8℃條件下離心20 min左右(2 000～3 000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清備用，離心后如有渾濁形成，應(yīng)再次離心。從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；樣本孔中加入待測樣本 50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μl)，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次(也可用洗板機(jī)洗板)；每孔加入底物 A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液 50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

4.質(zhì)量控制：所有調(diào)查人員均經(jīng)專門的培訓(xùn)，調(diào)查人員采用一對一面對面訪談的方式對產(chǎn)婦進(jìn)行調(diào)查，由孕婦本人應(yīng)答，問卷由調(diào)查人員填寫。為幫助被調(diào)查者更準(zhǔn)確的估計食物攝入量，調(diào)查人員采用實物模型和食物標(biāo)準(zhǔn)圖譜供被調(diào)查者參考。問卷的錄入采用雙人雙錄入，若兩次結(jié)果有不一致之處，則會及時與原始問卷進(jìn)行核對，對錯誤數(shù)據(jù)進(jìn)行修正。

5. 統(tǒng)計學(xué)處理：分類變量將采用頻數(shù)(構(gòu)成比，%)；連續(xù)變量根據(jù)數(shù)據(jù)情況采用平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、四分位區(qū)間進(jìn)行描述，對于服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，對于不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用中位數(shù)及四分位數(shù)[P25，P75]表示；組間差異性檢驗時，連續(xù)變量采用t檢驗(正態(tài)分布和方差齊性)比較兩組間計量資料的差異；多組計量資料比較采用方差分析(正態(tài)分布和方差齊性)；采用多變量線性回歸法分析產(chǎn)婦孕早期NLR與成熟乳中的sIgA濃度之間的關(guān)系，納入方程的變量包括年齡、BMI、母乳天數(shù)、產(chǎn)次、早產(chǎn)、生產(chǎn)方式、平均每日蛋白質(zhì)攝入量、平均每日能量攝入量和體力活動，以P≥0.1作為變量剔除標(biāo)準(zhǔn)。

妊娠期高血壓/糖尿病與炎癥和母乳中的sIgA相關(guān)，為探討二者關(guān)聯(lián)是否受疾病狀態(tài)的影響，以是否患有妊娠期高血壓/糖尿病進(jìn)行分層分析。此外，考慮到由于可能的生理性和病理性因素，部分中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞絕對數(shù)出現(xiàn)較偏離的異常值，為避免這些異常值對結(jié)果產(chǎn)生影響，故進(jìn)一步進(jìn)行敏感性分析，去掉孕早期中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的5%最高值，再次進(jìn)行多變量線性回歸分析。

使用EpiData 3.1 建立數(shù)據(jù)庫。所有統(tǒng)計分析均采用Stata 14.0軟件實現(xiàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人群特征分布情況

研究對象懷孕時的年齡不服從正態(tài)分布，使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[P25，P75]描述，中位年齡為30.9[28.9，34.0]歲，17.5%(36/206)的人孕前BMI偏高。此次收集的母乳中位天數(shù)為44.0[42.0，49.0] d成熟乳。除漢族外，還有6.4%(13/203)的人來自藏族、滿族、回族、瑤族和阿昌族。所有研究對象中，有19.9%(41/206)名產(chǎn)婦患有妊娠期高血壓或糖尿病。研究對象哺乳期平均每日蛋白質(zhì)攝入量中位水平為107.4[82.8，124.1] g/d，高于中國營養(yǎng)學(xué)會推薦值(80 g/d)[12]；平均每日能量攝入量中位水平為1 960.3[1 602.2，2 325.5] kcal/d。見表1。

28.4%(58/204)的研究對象孕早期中性粒細(xì)胞絕對數(shù)偏高(大于6.3×109/L)，4.4%(9/204)淋巴細(xì)胞絕對數(shù)異常(小于1.1×109/L或大于3.2×109/L)。產(chǎn)婦孕早期的NLR中位水平為2.9[2.2, 3.5]，最小值1.3，最大值6.8；當(dāng)不納入本研究中患有妊娠期糖尿病與高血壓的產(chǎn)婦后，剩余人群的中位NLR為2.8[2.2，3.5]。母乳中的sIgA平均濃度為(1 798.1±213.0)μg/ml。

表1 研究人群基本特征

二、孕早期NLR與母乳中的sIgA的多變量線性回歸

采用多變量線性回歸，變量篩選選擇逐步后退法。模型F=3.09，P=0.004， 包含NLR、年齡、體力活動、哺乳天數(shù)、產(chǎn)次、每日能量攝入量和每日蛋白質(zhì)攝入量7個變量的模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高32.6 μg/ml；年齡每增加1歲，sIgA濃度降低7.1 μg/ml；隨著母乳天數(shù)的增加，sIgA濃度降低(β=-1.4)；經(jīng)產(chǎn)婦與初產(chǎn)婦相比，其母乳中的sIgA含量增加。見表2。

三、分層分析

以是否患有妊娠期高血壓或糖尿病對孕早期NLR與母乳中的sIgA之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分層分析?；疾∪巳号c非患病人群的孕早期NLR中位數(shù)分別為3.0[2.2，3.6]和2.6[2.1，3.5]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA濃度升高72.6 μg/ml(P=0.04)；在非患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA濃度升高26.9 μg/ml，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.12)。見表3。

四、敏感性分析

剔除孕早期中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的偏高值后，剩余169例，NLR中位數(shù)為2.8[2.2，3.5]。模型F=4.01，P<0.01， 包含NLR、年齡、體力活動、哺乳天數(shù)、產(chǎn)次和每日蛋白質(zhì)攝入量6個變量的模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高45.4 μg/ml。見表4。

討 論

本研究對產(chǎn)婦成熟乳中的sIgA進(jìn)行檢測，并探討了產(chǎn)婦孕早期的NLR水平對sIgA濃度的影響。結(jié)果顯示，在調(diào)整了年齡、BMI、母乳天數(shù)、產(chǎn)次、早產(chǎn)、生產(chǎn)方式、經(jīng)能量調(diào)整的平均每日蛋白質(zhì)攝入量后，孕早期妊娠期婦女的炎性水平與42 d成熟乳中的免疫成分sIgA濃度呈正相關(guān), 當(dāng)NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高32.6 μg/ml。當(dāng)剔除中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞5%的偏高值后，孕早期NLR水平與sIgA濃度關(guān)系的結(jié)論不變。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中，尚無研究產(chǎn)婦孕早期的NLR水平與母乳sIgA濃度關(guān)系的報道。NLR的檢測方法簡單，計算方便，只需要通過全血細(xì)胞分析獲得淋巴細(xì)胞絕對數(shù)與中性粒細(xì)胞絕對數(shù)，經(jīng)濟(jì)高效，是系統(tǒng)炎癥的重要指標(biāo)，目前已被廣泛用于炎性疾病、腫瘤、心血管疾病等的預(yù)測[13-14]。而本研究第一次提出了孕早期NLR水平是成熟乳中sIgA濃度的影響因素。

表2 孕早期NLR與母乳中的sIgA多變量線性回歸

表3 孕早期NLR與母乳中的sIgA分層分析

表4 孕早期NLR與母乳中的sIgA敏感性分析

以是否患有妊娠期高血壓和糖尿病進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，疾病組孕早期NLR水平與母乳中的sIgA濃度關(guān)聯(lián)強(qiáng)度更高(β=72.6),說明患病人群更加敏感。已有研究表明，妊娠期高血壓和妊娠期糖尿病受母體炎癥狀態(tài)的影響[8, 15]，而對是否患有妊娠期糖尿病，兩組間的母乳sIgA濃度存在差異[6]，因此，炎癥、疾病與母乳免疫成分之間可能存在關(guān)聯(lián)，但具體的機(jī)制目前尚不清楚。有研究提示，對于妊娠期糖尿病人群，炎癥狀態(tài)可能通過誘發(fā)高血糖進(jìn)而引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞功能降低來影響sIgA[6]，但更多的大樣本人群研究和機(jī)制研究有待補(bǔ)充。

炎癥對于女性成功繁殖至關(guān)重要，從月經(jīng)周期到懷孕初期以及分娩后期，生育過程的每個步驟都涉及炎癥過程，而孕早期處于促炎狀態(tài)，如IL-8、MCP-1/CCL-2升高[16]。本研究收集的孕早期血常規(guī)結(jié)果顯示，28.4%中性粒細(xì)胞絕對數(shù)偏高，4.4%淋巴細(xì)胞絕對數(shù)異常，但目前尚未有研究定論孕產(chǎn)婦的NLR正常參考值范圍。Viktoria等對希臘129名孕婦(流產(chǎn)VS正常生產(chǎn))孕早期的NLR水平進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果顯示正常生產(chǎn)組孕婦孕早期的NLR為(2.5±1.0)[17]；以色列地區(qū)孕早期正常人群為(2.60±1.01)[18]；比利時安特衛(wèi)普大學(xué)醫(yī)院的138名對照組孕婦20周之前的NLR水平為(3.08±1.07)[19]。當(dāng)剔除本研究中患有妊娠期合并癥的產(chǎn)婦后，剩余人群的中位NLR為2.8[2.2，3.5]，與多數(shù)研究相似，這也為中國女性孕早期的NLR水平提供了一個參考。

婦女孕早期炎癥狀態(tài)生理性增高，就母乳中的免疫球蛋白來說是有利的，sIgA濃度升高，將有助于保護(hù)嬰兒免受病原體和毒素?fù)p害。本研究中，母乳中的sIgA平均濃度為(1 798.1±213.0)μg/ml，但是不同地區(qū)的研究結(jié)果不同。重慶地區(qū)產(chǎn)婦產(chǎn)后3 d以后的成熟乳sIgA含量為(1 548.3±1 634.4)μg/ml(ELISA雙抗體夾心法)[20]。一項研究調(diào)查了河/湖地區(qū)、沿海地區(qū)和內(nèi)陸地區(qū)產(chǎn)婦母乳中的免疫因子，結(jié)果顯示，產(chǎn)后28 d母乳中的sIgA中位濃度分別為438[370，667]、511[430，584]和488[384，736] μg/ml[21]。上海某醫(yī)院產(chǎn)后42 d門診收集的母乳，-80℃保存24周后，sIgA含量為6 743[3 076，13 239]μg/ml(ELASA法)[22]。對于國外的情況，一項研究收集了91位日本產(chǎn)婦的母乳，結(jié)果顯示，產(chǎn)后8周母乳中的sIgA濃度為1 084.7 μg/ml(酶免疫法)[23]。

本研究的優(yōu)勢在于補(bǔ)充了孕早期炎癥水平與母乳中的免疫成分之間的關(guān)系，以往的sIgA相關(guān)因素探討多聚焦于人群特征和產(chǎn)后因素，鮮有關(guān)注孕期因素，因此今后的研究可更多的利用孕期信息來探討其對母乳成分的影響。此外，本研究還調(diào)整了膳食因素，進(jìn)一步控制了混雜，使得二者之間的關(guān)聯(lián)更加準(zhǔn)確。膳食調(diào)查采用FFQ,能夠以相對簡單、經(jīng)濟(jì)高效且省時的方式評估長期飲食攝入量；估算營養(yǎng)素攝入量時，參考了最新的食物成分表；在考慮疾病的風(fēng)險時，最基本的關(guān)注點是總能量攝入量調(diào)整后的營養(yǎng)素攝入量，而不是營養(yǎng)素的絕對攝入量，因此模型同時納入了總能量攝入量和體力活動。然而，由于缺少吸煙信息，模型中調(diào)整的因素不夠全面，不過中國女性吸煙并不普遍，對處于孕期和哺乳期的女性更是如此，因此帶來的偏倚可能較小。

綜上所述，本研究采用NLR作為母體孕早期的炎癥狀態(tài)標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)孕早期NLR水平與成熟乳中的sIgA濃度呈正相關(guān)。今后可綜合考慮整個孕期的炎癥狀態(tài)，探討這一復(fù)雜的生理現(xiàn)象是如何對母乳中的成分產(chǎn)生影響的。