李審微 洪艷云 李新文 何可佳 戴良英 盧曉鵬 宋娜 易圖永

摘要：【目的】明確柑橘砂皮病不同發(fā)病等級及噴施生防菌枯草芽孢桿菌M-23后柑橘葉際細菌群落結(jié)構(gòu)的變化，揭示生防菌防治柑橘砂皮病的葉際微生物學機制，為進一步研究柑橘砂皮病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。【方法】試驗設(shè)對照區(qū)和噴施生防菌區(qū)2個區(qū)域，噴施生防菌區(qū)分別在2019年3月中旬柑橘春梢長2～3 cm、4月中旬、謝花2/3、果實蠶豆大小和果實乒乓球大小時噴施M-23菌株發(fā)酵液，噴藥液量3 L/株;同時對照區(qū)噴施等量的滅菌NB液體培養(yǎng)基，在最后一次噴施生防菌15 d 后進行防效調(diào)查。采集噴施生防菌區(qū)柑橘葉片（R4處理，病情等級0級）和未噴施生防菌區(qū)不同發(fā)病等級的柑橘葉片（R1、R2和R3處理，病情等級分別為0、5和9級），使用FastDNA[?] Spin Kit for Soil試劑盒提取柑橘葉片葉際微生物總DNA，通過Illumina MiseqTM高通量平臺測序分析微生物群落多樣性。【結(jié)果】生防菌M-23對柑橘砂皮病的防治效果達74.02%。高通量測序共獲得571091條序列，單一樣品序列數(shù)17833～96147條，在97%的相似水平下進行生物信息統(tǒng)計分析聚類后獲得2932個OTUs。4個處理的OTUs數(shù)量分別為1944、1545、1205和607個，表現(xiàn)為R1>R2>R3>R4。在門水平的組成上主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）組成。變形菌門是優(yōu)勢菌門，在R1、R2、R3和R4處理中的相對豐度分別為81.84%、87.93%、86.80%和68.82%。對照區(qū)的葉際微生物多樣性與發(fā)病等級成反比;噴施生防菌后柑橘葉片葉際細菌群落多樣性降低，在屬水平上芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度得到明顯增加，芽孢桿菌屬的相對豐度達33.41%。【結(jié)論】噴施生防菌M-23能有效防治柑橘砂皮病。M-23菌株能在柑橘葉片上定殖和增殖，改善葉際細菌群落結(jié)構(gòu)，提升有益菌的比例，使病情指數(shù)降低，具有一定的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 柑橘砂皮病;葉際細菌;生防菌;高通量測序;多樣性

中圖分類號： S436.66? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1699-07

Abstract：【Objective】Focusing on different severities of Diaporthe citri and the shifts of bacterial community diversity in citrus phyllosphere after spraying with Bacillus subtilis M-23， this study was to reveal the phyllospheric microbiological mechanism of controlling D. citri with biocontrol bacteria and provide theoretical basis for further studies on biological control of D. citri. 【Method】The experiment was conducted in two areas—the control area and the treatment area. In the treatment area， biocontrol bacteria M-23 was sprayed in the middle of March， 2019， when the citrus spring tip grew 2-3 cm， in the middle of April，? 2/3 of flowers fell， the citrus size was like broad bean and the citrus size was like ping-pong ball， evenly onto citrus leaves with an inoculum of 3 L/plant. At the same time， the control area was sprayed with the same amount of sterilized NB medium. The control effect was investigated 15 d after the last application of biocontrol agents. Collecting leaves with different incidence grades in the sprayed areas（R4 treatment， incidence grade 0） and unsprayed areas（R1， R2 and R3 treatments，incidence grades 0， 5 and 9 respectively）. FastDNA[?] Spin Kit for Soil kit was used to extract the total DNA of phyllosphere microorganisms， and the diversity of? microbial community was analyzed by Illumina MiseqTM high throughput platform sequencing method. 【Result】The result showed that the control effect of biocontrol bacterium M-23 on D. citri was 74.02%. A total of 571091 high quality sequences were obtained by high throughput sequencing， the number of single sample sequences ranged from 17833 to 96147， and 2932 OTUs were obtained by bioinformatics statistical analysis clustering at a similar level of 97%. The number of OTUs of the four treatments were 1944， 1545， 1205 and 607， respectively，in the following order：R1>R2>R3>R4. The horizontal composition of the phylum was mainly composed of Proteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Actinomycetes， Fusobacteria， Armatimonadetes， Acidobacteria and Verruciformis. Proteobacteria were dominant， and the relative abundances in R1， R2， R3 and R4 treatments were 81.84%， 87.93%， 86.80% and 68.82%， respectively. In the control area，phyllosphere microbial diversity was inversely proportio-nal to the incidence level. After spraying the biocontrol agent， the diversity of the bacterial community in the phyllosphere decreased， and the relative abundance of Bacillus and Pseudomonas increased obviously at the genus level， the relative abundance of Bacillus reached 33.41%. 【Conclusion】To sum up， spraying M-23 can effectively prevent the occurrence of D. citri. M-23 can colonize and proliferate on citrus leaves， which improves the community structure of phyllosphere bacteria， increases the proportion of beneficial bacteria， and reduces the disease index. Therefore， B. subtilis M-23 has certain application potential.

Key words： Diaporthe citri; phyllosphere bacteria; biocontrol bacteria; high-throughput sequencing; diversity

Foundation item： Post Scientist Project of Modern Agriculture（Citrus） Industrial Technology System（CARS-26）; Citrus Plant Protection Post Expert of Hunan Fruit Industry Technology System（Xiangnongfa〔2015〕137）; Hunan Agricultural Universitys “Double First-Class” Construction Sub-project（SYL2019027）; Hunan Agricultural University Youth Science Foundation Project（19QN30）

0 引言

【研究意義】近年來，柑橘砂皮病在湖南省大面積發(fā)生，且日益嚴重，給湖南省柑橘產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（馬靖艷等，2019）。柑橘砂皮病菌（Diaporthe citri）為弱寄生菌，在樹體受傷或樹勢衰弱時進行侵染，特別是侵染葉片和果實，常在表面形成黑色麻點，嚴重影響果實外觀和品質(zhì)，影響其經(jīng)濟價值（方天露，2017）。目前，防治柑橘砂皮病主要依靠化學藥劑防治，每年需進行6次以上噴施才有較好的控制效果。大量化學藥劑的使用極易導致病原菌產(chǎn)生抗性和農(nóng)藥殘留，影響環(huán)境微生物的平衡（周娜等，2015）。生物防治措施因?qū)Νh(huán)境友好、安全程度高、不會造成藥物殘留而受到研究者們的重視。因此，研究柑橘砂皮病不同發(fā)病等級柑橘葉片葉際微生物多樣性，探究噴施生防菌對葉際微生物多樣性的影響，有助于從微生態(tài)分析中發(fā)現(xiàn)柑橘砂皮病病害與微生態(tài)之間的關(guān)系，明確芽孢桿菌對柑橘砂皮病的抗病機制，為防治柑橘砂皮病提供新思路?！厩叭搜芯窟M展】高爽等（2016）綜述了植物葉際微生物群落的組成、特點及與外界環(huán)境的互作，發(fā)現(xiàn)不同因素均會對葉際微生物群落組成造成一定影響，其變化有規(guī)律可循，微生物群落組成的改變會影響寄主植物的生長。化學農(nóng)藥的使用對植物葉際微生物群落的影響較大，謝蘭芬等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，使用百菌清處理玉米葉片對其葉際微生物的影響較大，而解淀粉芽孢桿菌與噴施環(huán)境兼容性良好，是一種生態(tài)、環(huán)境友好的防治手段。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，擴增子測序分析技術(shù)逐漸在植物葉際微生物多樣性的研究中得到廣泛使用（Bodenhausen et al.，2013）。羅路云等（2017）比較了不同發(fā)病等級下植物葉際微生物種群的多樣性，發(fā)現(xiàn)由于病害的發(fā)生，植物葉際細菌種群會發(fā)生顯著變化，發(fā)病葉片葉際細菌多樣性明顯低于健康葉片葉際細菌多樣性。Zhang等（2008）研究蘇云金芽孢桿菌對微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)接種蘇云金芽孢桿菌后辣椒葉際微生物結(jié)構(gòu)受到影響，微生物多樣性降低。岑?。?016）將多粘類芽孢桿菌噴施在茶葉上，發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌可在葉際定殖，施用生防菌后在實現(xiàn)良好促生和病害抑制作用的基礎(chǔ)上減少了葉際細菌群落的相對豐度，但對于群落的組成和體系的穩(wěn)定影響較小?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對柑橘砂皮病的研究主要集中在其發(fā)生規(guī)律和化學防治上，生物防治也僅限于基礎(chǔ)的生防菌篩選，沒有對柑橘砂皮病不同發(fā)病等級葉際細菌群落多樣性的差異性比較和施用生防菌發(fā)酵液后葉際細菌群落結(jié)構(gòu)變化方面的研究。生防菌M-23由湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院園藝作物病害研究室篩選獲得，通過前期研究發(fā)現(xiàn)其能抑制柑橘砂皮病病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，但未對其田間防治效果及對柑橘葉際微生物的影響進行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過生防菌M-23對柑橘砂皮病防治的田間試驗，利用高通量測序技術(shù)比較不同處理下柑橘葉際細菌群落多樣性的差異，探究生防菌防治柑橘砂皮病的機制，為柑橘砂皮病的生物防治提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試生防菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subti-lis）M-23，由湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院園藝作物病害研究室分離獲得。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗地概況 試驗地位于湖南省懷化市洪江市雙溪鎮(zhèn)柑橘園藝場，該橘園于1986年建園，品種為冰糖橙，柑橘砂皮病發(fā)生較重。

1. 2. 2 試驗設(shè)計 試驗設(shè)對照區(qū)和噴施生防菌區(qū)2個區(qū)域。將生防菌M-23活化后以0.8%的接種量接種于滅菌的NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d后備用。噴施生防菌區(qū)分別在2019年3月中旬柑橘春梢長2～3 cm、4月中旬、謝花2/3、果實蠶豆大小和果實乒乓球大小時噴施生防菌發(fā)酵液，使用人工背負式電動噴霧器對葉片進行噴灑，噴藥液量3 L/株;同時對照區(qū)以相同條件噴施等量的滅菌NB液體培養(yǎng)基。葉片采集設(shè)4個處理，其中對照區(qū)葉片采集根據(jù)柑橘砂皮病的病情等級（R1：0級，無病斑;R2：5級，每葉病斑51～75個;R3：9級，每葉病斑100個以上）對應(yīng)設(shè)R1、R2和R3處理，噴施生防菌區(qū)設(shè)R4處理（葉片無病斑）。

1. 2. 3 樣品采集方法 最后一次噴施生防菌15 d后，從對照區(qū)選擇3株柑橘樹分別采集R1、R2和R3處理的柑橘葉片。葉片采集采用五點取樣法，每株柑橘樹于東西南北中各選擇1個枝條，每枝條采集R1處理同等大小柑橘葉片1片，每處理共15片葉混合放入無菌采樣袋中，進行3次重復，共獲得3個樣品，分別命名為SP01、SP02和SP03;以同樣的方式采集R2和R3處理柑橘葉片樣品，R2處理的樣品命名為SP51、SP52和SP53，R3處理的樣品命名為SP91、SP92和SP93。從噴施生防菌區(qū)3棵不同柑橘樹上采集無病的柑橘葉片，方法同上，樣品命名為BS01、BS02和BS03。

1. 2. 4 防治效果調(diào)查 參照張岳等（2018）的方法對柑橘砂皮病進行分級：0級，無病;1級，葉片或果實上有1～25個病斑;3級：葉片或果實上有26～50個病斑;5級：葉片或果實上有51～75個病斑;7級：葉片或果實上有76～100個病斑;9級：葉片或果實上有100個病斑以上。收獲期間分別調(diào)查對照區(qū)和噴施生防菌區(qū)柑橘砂皮病病情指數(shù)并計算防治效果，每區(qū)調(diào)查3株柑橘樹，每株5個枝條，共調(diào)查15個枝條上葉片的發(fā)病情況。

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查

總?cè)~數(shù)×最高級代表值）×100

防治效果（%）=（對照區(qū)病情指數(shù)-防治區(qū)病情

指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100

1. 2. 5 葉際微生物總DNA提取 取葉片6 g加入滅菌的錐形瓶中，向錐形瓶加入pH 7的0.1 mol/L PBS緩沖液100 mL、吐溫-80 100 ?L。錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩10 min后，在恒溫搖床中以28 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)30 min，然后再次用超聲波振蕩器振蕩5 min，在無菌條件下用鑷子取出葉片。采用真空泵對錐形瓶中的液體進行抽濾，用0.45 ?m微孔濾膜收集微生物。使用FastDNA[?] Spin Kit for Soil試劑盒提取葉際微生物DNA，要求DNA濃度和純度的A260/A280為1.8～2.0。

1. 2. 6 16S rDNA的V3～V4區(qū)PCR擴增及測序 第一輪擴增，PCR引物為341F[5'-CCCTACACGACGCT CTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCA G-3']和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCG AGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。反應(yīng)體系30 ?L：2×Taq Master Mix 15 ?L，上、下游引物（10 μmol/L）各1 ?L，DNA模板10～20 ng，ddH2O補足至30 ?L。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，進行5個循環(huán);94 ℃預變性20 s;94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進行20個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。第二輪擴增，引物Illumina橋式PCR兼容引物。反應(yīng)體系30 ?L：2×Taq Master Mix 15 ?L，上、下游引物（10 μmol/L）各1 ?L，PCR產(chǎn)物20 ng（第一輪），ddH2O補足至30 ?L。擴增程序：95 ℃預變性3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進行5個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行高通量測序。

1. 3 數(shù)據(jù)處理與分析

Illumina MiseqTM平臺獲得的原始數(shù)據(jù)，通過質(zhì)控過濾后剔除嵌合體和非特異性擴增序列，得到的有效數(shù)據(jù)使用Usearc軟件以97%的默認相似性將序列聚類成為一個OTU。以聚類similarity值（0.86～0.99）為橫坐標、OTU數(shù)目變化（0～25000）為縱坐標制圖，本研究OTU分析和分析學分析選擇的similarity值為0.97。使用97%相似度的OTU，用Mothur進行Rarefaction分析（Asnicar et al.，2015），利用R制作稀釋曲線用來評估各樣品在測序強度間的差異。根據(jù)每個樣品文庫的OTU豐度信息，完成Alpha和Beta多樣性分析。計算Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)，評估序列文庫的多樣性。通過NMDS（Non-metric multidimensional scaling）分析4組不同處理微生物群落結(jié)構(gòu)間的差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 生防菌M-23對柑橘砂皮病的防治效果

由表1可知，對照區(qū)發(fā)病較嚴重，病情指數(shù)高達36.45;噴施生防菌區(qū)施菌后病情指數(shù)降低至9.47，防治效果明顯，防效達74.02%。說明生防菌M-23對柑橘砂皮病具有較強的拮抗作用。

2. 2 高通量測序數(shù)據(jù)預處理結(jié)果

利用高通量測序共得到571091條有效序列，單一樣品序列數(shù)17833～96147條，平均為47591條，對序列在97%相似水平下進行生物信息統(tǒng)計分析，獲得2932個OTUs。采用稀釋曲線來比較樣品間物種的豐度和試驗數(shù)據(jù)的合理性，如圖1所示，Shannon指數(shù)的稀釋曲線趨于平緩，可認為測序深度已基本覆蓋樣品中絕大多數(shù)物種，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

2. 3 OTU聚類分析結(jié)果

由圖2可看出，R1、R2、R3和R4處理分別有1944、1545、1205和607個OTUs，4個處理間的OTUs數(shù)量表現(xiàn)為R1>R2>R3>R4，說明未噴施生防菌且未發(fā)病的R1處理微生物種類最豐富，隨著病情指數(shù)的增加微生物種類豐富度隨之降低，噴施生防菌的R4處理微生物種類最少。

2. 4 Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果

目前，普遍認可種（Species）的分類水平為97%序列相似度（Gu et al.，2019），在該相似度水平下使用獲取的OTU分析各樣品的Alpha多樣性，通過Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)對柑橘葉際微生物多樣性進行評估，所得的參數(shù)如表2所示。由表2可知，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)的變化范圍分別為1.41～3.77、0.084～0.372、365.6～1256.5和413.7～1302.2。對噴施滅菌培養(yǎng)基的R1、R2和R3處理的Shannon指數(shù)進行比較，表現(xiàn)為R1>R2>R3，表明微生物多樣性隨著病情指數(shù)的升高而降低;噴施生防菌的R4處理與噴施滅菌培養(yǎng)基的R1、R2和R3處理相比，噴施生防菌后Simpson指數(shù)顯著降低（P<0.05），與OTU聚類分析結(jié)果吻合。

2. 5 NMDS非度量多維尺度分析結(jié)果

根據(jù)非度量多維尺度分析結(jié)果（圖3），R2和R3處理與R1處理在坐標軸上有一定距離，表明柑橘砂皮病的發(fā)生導致葉際細菌群落結(jié)構(gòu)改變;R4處理與R1、R2和R3處理距離較遠，說明生防菌的加入改變了葉際細菌的群落結(jié)構(gòu)。如圖3所示，相同處理的重復能緊密靠在一起，不同處理間可明顯區(qū)分，各處理間有明顯差異性，相同處理間群落相似度較高，未噴施生防菌不同病情等級條件下的葉際細菌群落與生防菌處理的細菌群落可明顯區(qū)分開來。使用非參數(shù)檢驗方法Anosim做進一步分析，根據(jù)分析結(jié)果（表3）可知，R接近1，說明4個處理的組間差異大于組內(nèi)差異，P=0.011，小于0.05，說明分析結(jié)果具有統(tǒng)計學上的顯著性差異。

2. 6 高通量測序分析柑橘葉際細菌群落結(jié)構(gòu)

柑橘葉際細菌群落門水平和屬水平在各分組樣品中相對豐度≥1%的組成情況見圖4和圖5。在門水平上主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）組成（圖4）。其中變形菌門占絕對優(yōu)勢，在R1、R2、R3和R4處理中的相對豐度分別為81.84%、87.93%、86.80%和68.82%，噴施滅菌培養(yǎng)基處理的R1處理與R2和R3處理相比，變形菌門的相對豐度隨著病情等級升高而升高，R2處理與R3處理間無明顯差異，噴施生防菌后R4處理中變形菌門的相對豐度有所下降;發(fā)病后降低了浮霉菌門的相對豐度;噴施滅菌培養(yǎng)基處理組的厚壁菌門的相對豐度均在10.00%以下，而噴施生防菌后R4處理組厚壁菌門的相對豐度為34.89%，相對豐度明顯增加。

進一步對各分組樣品在屬水平（OTU數(shù)相對豐度≥1%）的相對豐度進行研究，結(jié)果（圖5）表明，不同樣品的主要葉際細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和馬賽菌屬（Massilia）為R1、R2和R3處理的共有優(yōu)勢菌屬，黃單胞菌屬（Xanthomonas）為R2和R3處理的共有優(yōu)勢菌屬。橘園發(fā)病后假單胞菌屬的豐度降低，噴施生防菌后明顯上升，在R4處理組中達最高（42.79%）。鞘氨醇單胞菌屬和黃單胞菌屬在發(fā)病后相對豐度先明顯升高，然后略微下降，可能與致病菌存在協(xié)同作用。噴施生防菌后R4處理的細菌主要由假單胞菌屬和芽孢桿菌屬（Bacillus）組成，芽孢桿菌屬在R4處理中的相對豐度達33.41%，說明M-23菌株在葉際得到較好的定殖。

3 討論

近年來，湖南省懷化地區(qū)由于降水增加、溫度上升、果農(nóng)對柑橘園管理不當、化學農(nóng)藥濫用等導致柑橘砂皮病發(fā)生越來越嚴重，給柑橘的品質(zhì)帶來嚴重影響（馬靖艷等，2019），造成重大經(jīng)濟損失。生物防治是防治柑橘砂皮病最有效的綠色防治措施，通常是在植物生長的自然環(huán)境中獲得對病原菌有拮抗作用的生防菌株來防治病害，這種生物防治的方法可維持葉際微生物生態(tài)系統(tǒng)的平衡（Wang et al.，2019）。

植物病害的發(fā)生會影響其環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)變化，多樣性和均勻性隨著病害的發(fā)生而降低，化學農(nóng)藥的噴施會影響環(huán)境微生物的生態(tài)平衡，而生防菌可優(yōu)化環(huán)境微生物的組成（李春宏等，2019;李忠奎等，2019）。岑浴（2016）研究多粘類芽孢桿菌在茶葉上的定殖及其對葉際細菌群落的影響時發(fā)現(xiàn)，生防菌在葉片上定殖作為一種生物刺激，可改良葉際細菌的生態(tài)環(huán)境，并不會產(chǎn)生生物入侵的作用打破葉際微生物的生態(tài)平衡造成生態(tài)環(huán)境的紊亂。謝蘭芬等（2018）在生防菌對玉米葉際微生物影響的研究中證明殺菌劑嚴重降低了玉米葉際微生物的代謝活動，而解淀粉芽孢桿菌與噴施環(huán)境兼容性良好。Zhang等（2008）探究黃瓜和辣椒的葉際使用蘇云金芽孢桿菌對其葉際微生物結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示蘇云芽孢桿菌會降低微生物的多樣性。本研究中R1處理（發(fā)病等級為0級）的Chao1、Shannon和ACE指數(shù)均大于其他處理，Simpson指數(shù)小于其他處理，在病害入侵后其葉際微生物多樣性和豐富度較健康葉際微生物有所降低;噴施生防菌的R4處理Chao1、Shannon和ACE指數(shù)的降低可能是因為柑橘葉片噴施生防菌后，突然有大量生防菌加入，其他葉際微生物的定殖受到一定影響，從而提升了有協(xié)同作用菌群的相對豐度，抑制了部分菌群的定殖，因此導致葉際微生物的多樣性有所降低，與Zhang等（2008）的研究結(jié)果一致。

在葉際細菌菌群結(jié)構(gòu)的組成中，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門是4個處理共有的菌門，變形菌門和厚壁菌門是其優(yōu)勢菌門，厚壁菌門在R4處理中所占的比例最高，為34.89%，明顯高于未噴施生防菌的R1、R2和R3處理，其原因是噴施生防菌后枯草芽孢桿菌M-23在葉際得到良好定殖，增加了生防菌株所屬門的相對豐度;變形菌門主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱，盡管變形菌門在不同物種葉際的相對豐度不一致，但均為葉際細菌中的優(yōu)勢門類，與Laforest-Lapointe和Whitaker（2019）對葉際細菌群落研究得出的結(jié)果一致。變形菌門中很多細菌對周邊環(huán)境的平衡起到重要作用，其中γ-變形菌綱中的假單胞菌屬在4個處理中占據(jù)優(yōu)勢地位，與劉暢等（2020）測定的煙草葉際微生物多樣性的研究結(jié)果基本一致。隨著病原菌的侵染假單胞菌屬的相對豐度下降，噴施生防菌后抑制了病害的發(fā)生，其相對豐度明顯上升，遠高于其他處理，推測是假單胞菌屬與噴施的生防菌M-23在葉際的互作對植物起到一定的保護作用。沙月霞和沈瑞清（2019）研究發(fā)現(xiàn)，3種芽胞桿菌浸種處理顯著改變水稻根和莖部內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)，提高了假單胞菌屬的相對豐度，本研究結(jié)果與之一致。假單胞菌屬作為葉際微生物的組成，隨著病害的發(fā)生或生防菌的噴施其相對豐度發(fā)生變化，可能與植物防御病原物入侵有關(guān)。有研究表明，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）產(chǎn)生的生物活性分子（冠菌素Coronatine和一種蛋白酶體抑制劑Sy- ringolin A）能引起氣孔關(guān)閉，從而影響病原體進入質(zhì)外體（Hunter et al.，2010）。Ko等（2014）分離得到的一株假單胞菌菌株THJ609-3對柑橘砂皮病有較好的防效，可抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)。此前也有學者發(fā)現(xiàn)多種生防菌聯(lián)合使用可提高對病害的防治效果，譙天敏等（2015）將銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）與長枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）2種生防菌聯(lián)合使用，對雜交竹梢枯病的協(xié)同防效得到顯著提高;Wang等（2019）使用枯草芽孢桿菌和哈茨木霉組成的生物產(chǎn)物能有效防治馬鈴薯瘡痂病。因此，芽孢桿菌屬與假單胞菌屬聯(lián)合使用以有效防治柑橘砂皮病有待進一步探究。

本研究運用高通量測序技術(shù)檢測柑橘葉際細菌群落結(jié)構(gòu)，比較柑橘砂皮病不同發(fā)病等級下葉際細菌群落組成的區(qū)別和噴施生防菌后葉際菌群的變化，有助于深層次了解柑橘健康葉片與砂皮病葉的微生態(tài)差異，為研究柑橘砂皮病的防治提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

噴施生防菌M-23能有效防治柑橘砂皮病。在柑橘砂皮病發(fā)生較嚴重的柑橘園中噴施生防菌M-23后，M-23菌株能在柑橘葉片上定殖和增殖，改善葉際細菌群落結(jié)構(gòu)，提升有益菌的比例，使病情指數(shù)降低，具有一定的應(yīng)用潛力。

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（責任編輯 麻小燕）