陳錫 趙德剛 陳瑩 吳佳海 袁暘暘 王小利

摘要：【目的】克隆高羊茅谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因FaGST1，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析，為深入研究該基因的抗逆分子調(diào)控提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦T-PCR和RACE從高羊茅黔草1號(hào)中克隆FaGST1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建植物融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaGST1-GFP，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草葉片表皮細(xì)胞，觀察FaGST1基因亞細(xì)胞定位情況，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高鹽、高溫、干旱及低氮脅迫處理下高羊茅葉片中該基因的表達(dá)情況。【結(jié)果】克隆獲得FaGST1基因cDNA全長(zhǎng)序列為1003 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為681 bp，編碼227個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白的分子量約25.60 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.58，親水指數(shù)平均值-0.342，不穩(wěn)定系數(shù)32.96，為穩(wěn)定的親水蛋白，定位于細(xì)胞核。FaGST1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占50.44%，β-轉(zhuǎn)角占5.75%，無(wú)規(guī)則卷曲占30.54%，延伸鏈占13.27%。FaGST1蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)楹蠫位點(diǎn)的N末端結(jié)構(gòu)域和含有H位點(diǎn)的C末端結(jié)構(gòu)域。FaGST1蛋白與黑麥草GST蛋白（AMY26594.1）的氨基酸序列相似性最高，為93%，其次是海濱雀稗GST蛋白（AMN87043.1），為91%，與玉米（ACG39365.1）和小米（KQK86785.1）GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上，與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果基本相符，即FaGST1蛋白與黑麥草、海濱雀稗、玉米和小米等禾本科植物GST蛋白親緣關(guān)系較近。高羊茅FaGST1基因在干旱、高溫、高鹽脅迫和低氮脅迫處理下均出現(xiàn)抑制表達(dá)?！窘Y(jié)論】FaGST1基因負(fù)向調(diào)控高羊茅逆境脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 高羊茅;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）;基因克隆;亞細(xì)胞定位;生物信息學(xué)分析;非生物脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S543.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）07-0000-11

Abstract：【Objective】Glutathione-S-transferase（GSTs） gene FaGST1 form tall fescue was cloned，subcellular locali-zation and expression analysis was analyzed in order to provide reference for molecular regulation of stress resistance study of the gene. 【Method】FaGST1 gene was cloned by RT-PCR and RACE from tall fescue Qiancaoyihao， the structure and function of the protein were analyzed by bioinformatic software，and plant fusion expression vector pCAMBIA1300-FaGST1-GFP was constructed，which injected to tobacco epidermal cells through agrobacterium-mediated method，the subcellular localization of FaGST1 gene was observed，and FaGST1 gene expression level in tall fescue leaves under salt stress， heat stress，drought stress and low nitrogen stress was analyzed by qRT-PCR. 【Result】The sequence analysis results showed that the full-length cDNA（1 003 bp） was obtained with a 681 bp open reading frame（ORF），which encoded a small molecular protein containing 227 amino acids，the relative molecular weight of FaGST1 protein was about 25.60 kDa and its theoretical isoelectric point（pI）? was 5.58. The grand average of hydropathicity was -0.342 and the instability index was 32.96， which was a stable hydrophilic protein. Subcellular localization results showed that FaGST1 was located on the cell uncleus. In the secondary structure of FaGST1 protein，including 50.44% of alpha helix， 5.75% of beta turn， 30.53% of random coil and 13.27% of extended strand were observed. FaGST1 protein conserved domain contained the GST-specific N-terminal domain （G site） and the C-terminal domain （H site）. FaGST1 protein had the highest amino acid sequence similarity with GST （AMY26594.1） of Lolium perenne，at 93%，and followed the amino acid sequence similarity with GST（AMN87043.1） of Paspalum vaginatum， at 91%. Its amino acid sequence similarities with GST （AMY26594.1） of Zea mays（ACG39365.1） and Setaria? italica（KQK86785.1） were over 80%， the results were basically consistent with phylogenetic evolution tree analysis. FaGST1 had close genetic relationship with the GST protein of Lolium perenne，P. vaginatum，Z. mays and S. italica. The qRT-PCR results showed that FaGST1 expression was down-regulated under drought stress，heat stress，salt stress and low nitrogen stress. 【Conclusion】The study results show that FaGST1 gene has negative regulation function under adversity stress response of tall fescue.

Key words： tall fescue; glutathione-S-transferase（GST）; gene cloning; subcellular localization; bioinformatics analysis，abiotic stress; expression analysis

Foundation item： Special Fund Project of the Guizhou Science and Technology Platform and Talent Team（QKHPTRC〔2018〕5634）; Science and Technology Plan Project of Guizhou（QKHJC〔2019〕1302）; Open Foundation of Key Laboratory of Ministry of Education（MOELP-201702）; Youth Foundation of Guizhou Academy of Agricultural Sciences（QNKYQNJJXM〔2018〕80）

0 引言

【研究意義】高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科羊茅屬多年生冷季型牧草，廣泛種植于溫帶地區(qū)，因具有四季常綠和耐踐踏的優(yōu)點(diǎn)，又被作為草坪草，應(yīng)用于園林綠化設(shè)計(jì)、保持水土及生態(tài)環(huán)保等方面。貴州是典型的喀斯特地區(qū)，地表崎嶇、土壤貧瘠、干旱頻發(fā)，氣候變化多樣，冷季型牧草或草坪草生長(zhǎng)較差（吳佳海等，2002）。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，GST）是廣泛存在于真核生物中催化還原型谷胱苷肽與各種疏電或親電化合物發(fā)生反應(yīng)的一種多功能蛋白酶，主要作用于植物代謝、誘導(dǎo)脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中（Gong et al.，2005;Eliana et al.，2006），還可作為天然植物生長(zhǎng)素（IAA）的載體（陳秀華等，2013）。因此，克隆高羊茅GST基因（FaGST1），并進(jìn)行亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析，以探究該基因在高羊茅非生物脅迫響應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)培育抗性強(qiáng)且適宜貴州生態(tài)環(huán)境的高羊茅新品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1970年Frear和Swanson首次在玉米植株中發(fā)現(xiàn)GST基因序列。隨著相關(guān)研究的深入，已從17個(gè)物種中相繼克隆獲得GST基因及其類似序列（Basantani and Srivastava，2007;Conn et al.，2008），其中，玉米（Zea mays）42個(gè)（Shimabukuro et al.，1970），擬南芥（Arabidopsis thaliana）54個(gè)（Dixon et al.，2002），水稻（Oryza sativa）59個(gè)（Moons，2003），楊樹(shù)（Populus）81個(gè)（Lan et al.，2009）。研究表明，GST是一類多功能蛋白家族，由分子量約26 kD的兩個(gè)亞基組成二聚體（同源或異源），兩個(gè)亞基均具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域的G位點(diǎn)是谷胱甘肽（GSH）特異結(jié)合的位點(diǎn)，氨基酸序列較保守，C端結(jié)構(gòu)域的H位點(diǎn)結(jié)合疏水底物，氨基酸序列可變性較大（Chen et al.，2003）。GST在重金屬、冷、熱、鹽、除草劑等非生物脅迫及病原侵染等生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Dudler et al.，1991;胡廷章等，2007）。如水稻OsGST2基因受稻瘟病菌誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，植株的抗病性提高（Agrawal et al.，2002）;橡膠HbGSTU1是一個(gè)典型的GST Tau家族基因，在橡膠樹(shù)割膠、傷害、低溫等逆境過(guò)程中發(fā)揮作用，可作為橡膠樹(shù)抗逆分子育種的靶標(biāo)基因（范玉潔等，2011）;小麥GST基因參與白粉病的應(yīng)答，提高植株的抗病性（吳金華等，2013）;番茄中多個(gè)GST基因家族成員受水楊酸和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，植株的抗脅迫能力明顯提高（Csiszár et al.，2014）;蘋(píng)果被斑點(diǎn)落葉病原菌侵染后MdGSTU1基因表達(dá)顯著上調(diào)，植株的抗病性明顯提高（安秀紅等，2014）;向日葵HaGSTU1基因表達(dá)上調(diào)，抗核盤(pán)菌能力明顯提高（馬立功等，2015），且向日葵GST基因表達(dá)受鹽、ABA、冷和熱等脅迫影響（凌云鶴等，2019）;山羊草GST基因也受干旱和鹽脅迫影響，在不同組織中表達(dá)水平存在明顯差異（馬建輝等，2018）;大蒜AsGST基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)（梁志樂(lè)等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】高羊茅是禾本科六倍體植物，已知的基因組信息量較少，至今鮮見(jiàn)關(guān)于高羊茅GST基因的相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以高羊茅品種黔草1號(hào)（Festuca arundinacea Schreb. cv. ‘Qiancao No.1）為材料，基于前期試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接獲得的GST基因序列，通過(guò)RT-PCR和RACE克隆FaGST1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)構(gòu)建融合表達(dá)載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)非生物脅迫下FaGST1基因的表達(dá)情況，為深入研究高羊茅GST基因的抗逆分子調(diào)控功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料高羊茅黔草1號(hào)是貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所牧草研究團(tuán)隊(duì)培育的牧草新品種，2005年通過(guò)國(guó)家審定（登記號(hào)299），種植于貴州獨(dú)山縣試驗(yàn)基地資源圃。該品種適應(yīng)性廣、坪用性好、抗逆性強(qiáng)、耐踐踏、產(chǎn)量高，且種子成熟期集中，是草坪草、綠化環(huán)境及生態(tài)治理的優(yōu)良草種。

TRIzolTM Kit RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE試劑盒和SYBR Green I熒光定量染料均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek Inc（美國(guó)）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。主要儀器設(shè)備：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System，Promega A6001）、PCR儀（Bio-Rad My-Cycler、GeneAmp PCR system 9700）、瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad Mini-Protean/Power Pac 300）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad GelDoc）。

1. 2 樣品處理及采集

選取飽滿、品質(zhì)優(yōu)良的高羊茅種子，播種于裝有標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液容器中，存放于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光強(qiáng)度5400 lx，光培養(yǎng)16 h/d，暗培養(yǎng)8 h/d，相對(duì)濕度60%，溫度（24±2）℃，常規(guī)管理7 d后分別進(jìn)行高鹽、高溫、干旱和低氮脅迫處理。高鹽脅迫處理：取健康生長(zhǎng)的高羊茅植株置于含有400 mmol/L NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中處理24 h。高溫脅迫處理：取健康生長(zhǎng)的高羊茅植株在42 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h。干旱脅迫處理：采用模擬干旱的方法將健康生長(zhǎng)的高羊茅植株置于30% PEG-6000溶液（滲透勢(shì)為-1.0 MPa）中處理24 h。低氮脅迫處理：將健康生長(zhǎng)的高羊茅植株轉(zhuǎn)移至無(wú)氮的水培液（營(yíng)養(yǎng)液中Cl-取代NO3-）中處理24 h。上述處理均以在標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)的高羊茅為對(duì)照。各處理的采樣時(shí)間均為0、0.5、1.0、2.0、6.0、12.0和24.0 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每處理3次重復(fù)。分別將同一時(shí)間采集的高羊茅鮮嫩葉片混合，液氮速凍后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA提取及cDNA合成

稱取高羊茅新鮮葉片0.1 g，參照TRIzol? Kit RNA試劑盒說(shuō)明提取總RNA，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ? μg總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit）說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 FaGST1基因克隆

根據(jù)前期試驗(yàn)獲得高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基因注釋，從中找出高羊茅GST基因?qū)?yīng)的Unigene序列，用Premier primer 5.0設(shè)計(jì)FaGST1基因的中間片段特異引物FaGST1-F1/FaGST1-R1（表1）。以高羊茅鮮嫩葉片的cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25.0 μL，2 mmol/L dNTPs 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（FaGST1-F1/FaGST1-R1）各2.0 μL，cDNA模板1.0 μL，KOD FX Neo（1 U/μL） 1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)充至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，4 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并照相記錄，置于紫外燈下迅速切下與目的片段大小一致的條帶，參照瓊脂糖DNA膠回收試劑盒說(shuō)明回收目的片段，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板，挑取陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用DNAMAN 6.0分析測(cè)序結(jié)果。結(jié)合5'-RACE和3'-RACE試劑盒說(shuō)明設(shè)計(jì)引物（FaGST1-F2/FaGST1-R2和FaGST1-F3/FaGST1-R3）（表1），然后參照5'-RACE和3'-RACE試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，最終獲得高羊茅FaGST1基因的5'端和3'端序列。利用瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段，使用DNAMAN 6.0將5'端和3'端序列與中間片段序列進(jìn)行拼接，獲得FaGST1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

1. 5 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用ORF Finder在線網(wǎng)站查找FaGST1基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）。使用ExPASy Proteomics Server中的ProtParam和ProtScale預(yù)測(cè)FaGST1蛋白的理化性質(zhì)。通過(guò)NCBI中的BLAST比對(duì)，搜索下載其他植物同源GST蛋白，并用DNAMAN 6.0進(jìn)行多重比對(duì)，最后利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor jointing，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。分別用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)FaGST1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 6 融合表達(dá)載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

以FaGST1-GFP-F/FaGST1-GFP-R為引物，利用高保真酶KOD FX Neo擴(kuò)增獲得FaGST1基因，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序見(jiàn)方法1.4，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收目的片段。用Kpn I和Xba I對(duì)目的片段和質(zhì)粒pCAMBIA1300-GFP進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行體外連接，以構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaGST1-GFP（圖1），用冷卻法將其轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。從測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌液中抽提質(zhì)粒備用。

將被轉(zhuǎn)入融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaGST1-GFP的農(nóng)桿菌過(guò)夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至含Kan和Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)16 h，再加入乙酰丁香酮和嗎啉乙磺酸（MES）。常溫下4000 r/min離心菌液10 min，丟棄上清液，用MgCl2溶液重懸菌體，加入MAS混勻，靜置3 h，作為后續(xù)試驗(yàn)的侵染液。取正處于生長(zhǎng)期的煙草葉片，葉片反面用針頭扎數(shù)個(gè)小孔，用注射器吸取侵染液，將其從葉片下表皮注射到葉片內(nèi)，作為處理組，以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1300-GFP的煙草葉片為對(duì)照。注射72 h后，撕取煙草表皮細(xì)胞置于激光共聚交熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光信號(hào)[綠色熒光蛋白（GFP）激發(fā)光為488 nm，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）激發(fā)光為405 nm]。

1. 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別稱取干旱、高溫、高鹽和低氮脅處理的高羊茅葉片各0.1 g，提取其總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體方法與1.2.1相同。將合成的cDNA稀釋20倍作為模板，以FaGST1-F4/FaGST1-R4為引物（表1），實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同脅迫處理下高羊茅葉片F(xiàn)aGST1基因的表達(dá)情況。在冰上配制反應(yīng)體系20.0 μL： cDNA模板2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（FaGST1-F4/FaGST1-R4）各1.0 μL，SYBR Premix Ex Taq（2×） 10.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。將反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。內(nèi)參基因?yàn)閁biquitin，其引物為UBI-F1/UBI-R1（李小冬等，2017）。生物學(xué)技術(shù)各設(shè)3次重復(fù)，樣品也各設(shè)3次重復(fù)。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算分析FaGST1基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Excel 2007整理分析數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 FaGST1基因cDNA克隆結(jié)果

以高羊茅鮮嫩葉片的cDNA為模板、FaGST1-F1/FaGST1-R1為引物，PCR擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約600 bp的清晰條帶（圖2-A），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段為FaGST1基因的中間片段，長(zhǎng)度為644 bp。采用RACE擴(kuò)增FaGST1基因的3'端和5'端，結(jié)果如圖2-B和圖2-C所示。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因5'端為174 bp，3'端為326 bp。利用DNAMAN 6.0將5'端和3'端序列與中間片段序列進(jìn)行拼接，獲得高羊茅GST基因cDNA序列全長(zhǎng)為1003 bp，ORF長(zhǎng)度為681 bp，編碼227個(gè)氨基酸殘基（圖3）。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

由圖4可知，F(xiàn)aGST1蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)楹蠫位點(diǎn)的N末端結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）和含有H位點(diǎn)的C末端結(jié)構(gòu)域（綠色）。ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)aGST1蛋白分子式為C1182H1798N294O336S3，原子總數(shù)為3613個(gè)，分子量約25.60 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.58，親水指數(shù)平均值-0.342，不穩(wěn)定系數(shù)32.96，為穩(wěn)定的親水蛋白（圖5）。SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)aGST1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占50.44%，β-轉(zhuǎn)角占5.75%，無(wú)規(guī)則卷曲占30.54%，延伸鏈占13.27%（圖6）。利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖7）顯示，其與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)，下載GenBank收錄的16種植物GST蛋白氨基酸序列，利用DNAMAN 6.0進(jìn)行多重序列比對(duì)，F(xiàn)aGST1蛋白與黑麥草GST蛋白（AMY26594.1）的氨基酸序列相似性最高，為93%，其次是海濱雀稗GST蛋白（AMN87043.1），為91%，與玉米（ACG39365.1）和小米（KQK86785.1）GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上（圖8）。由圖9可知，F(xiàn)aGST1蛋白先與黑麥草GST蛋白聚在一起，然后與海濱雀稗GST蛋白聚在一起，表明三者親緣關(guān)系較近，此外，F(xiàn)aGST1蛋白與玉米和小米GST蛋白親緣關(guān)系也較近，其原因可能是這些植物同屬禾本科，尤其是前三者均為禾本科牧草。

2. 4 FaGST1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果

將克隆獲得的FaGST1基因連接至pCAMBIA1300-GFP載體上，成功構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaGST1-GFP，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草表皮細(xì)胞，撕取煙草表皮細(xì)胞置于激光共聚交熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組整個(gè)煙草表皮細(xì)胞中分布非常強(qiáng)的綠色熒光，但處理組煙草表皮細(xì)胞僅細(xì)胞核能檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明FaGST1蛋白定位于細(xì)胞核（圖10）。

2. 5 不同脅迫處理下FaGST1基因表達(dá)分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高鹽、高溫、干旱及低氮脅迫處理下高羊茅葉片中FaGST1基因表達(dá)情況，結(jié)果（圖11）顯示，F(xiàn)aGST1基因的表達(dá)水平受到不同程度影響，與對(duì)照相比，高鹽脅迫6.0 h FaGST1基因極顯著下調(diào)表達(dá)（P<0.01，下同）（圖11-A）;高溫脅迫2.0 h FaGST1基因極顯著上調(diào)表達(dá)，但脅迫處理6.0和12.0 h時(shí)，其表達(dá)極顯著下調(diào)（圖11-B）;干旱脅迫0.5和12.0 h時(shí)FaGST1基因表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05，下同），但處理1.0 h時(shí)其表達(dá)顯著下調(diào)（圖11-C）;低氮脅迫0.5～24.0 h（除脅迫1.0 h外），F(xiàn)aGST1基因的表達(dá)呈極顯著下調(diào)（圖11-D）?？梢?jiàn)，F(xiàn)aGST1基因在干旱、高溫、高鹽和低氮脅迫處理下均出現(xiàn)抑制表達(dá)，表明FaGST1基因負(fù)向調(diào)控高羊茅逆境脅迫響應(yīng)。

3 討論

植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)受到不利生物環(huán)境條件如高溫、低溫、干旱、鹽漬等逆境脅迫影響時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)大量積累ROS，對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)造成不可逆性氧化損傷，從而引起細(xì)胞代謝異常，導(dǎo)致植株的生長(zhǎng)發(fā)育受阻（Mohsenzadeh et al.，2011;毛小輝等，2014）。由于GST的GSH具有還原作用，可清除植物細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS以修復(fù)受氧化損傷的細(xì)胞，維持植物體內(nèi)正常代謝，且GSH能結(jié)合除草劑，以致不傷害目的酶，說(shuō)明GST還具有降低異源物質(zhì)毒性的作用（陳秀華等，2013）。Moons（2003）研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和生長(zhǎng)素（IAA）能誘導(dǎo)水稻根中GST基因表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生大量GST蛋白清除ROS，表明該基因參與脅迫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制。此外，植物GST基因能應(yīng)答脫水、冷害、干旱、高鹽和脫落酸（ABA）等非生物脅迫（Fang et al.，2002）。Roxas等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，煙草植物中超表達(dá)GST/GPX基因可加速轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在冷脅迫條件下的生長(zhǎng);Yang等（2014）研究顯示，剛毛怪柳中ThGSTZ1基因過(guò)量表達(dá)可增加植物的抗旱和耐鹽能力，從而減少細(xì)胞的損傷?？梢?jiàn)，GST在植物響應(yīng)生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

目前，已有較多關(guān)于GST生理生化活性與植物抗性的研究報(bào)道，有關(guān)GST基因在植物中的表達(dá)調(diào)控研究也較多，但以高羊茅為研究對(duì)象的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，其原因可能是高羊茅為禾本科六倍體植物，已知的基因組信息量較少。本研究以高羊茅黔草1號(hào)為材料，通過(guò)RACE從高羊茅中獲得FaGST1基因cDNA全長(zhǎng)序列，具有完整ORF序列，其編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)區(qū)域包括含有G位點(diǎn)的N末端結(jié)構(gòu)域和含有H位點(diǎn)的C末端結(jié)構(gòu)域，與黑麥草GST蛋白的氨基酸序列相似度最高，然后與海濱雀稗的GST蛋白聚在一起，表明三者親緣關(guān)系較近，此外，F(xiàn)aGST1蛋白與玉米和小米GST蛋白親緣關(guān)系也較近，其原因可能是這些植物同屬禾本科牧草。推測(cè)其與小麥GST蛋白和水稻GST蛋白（毛小輝等，2014）氨基酸序列相似性也較高，原因是小麥和水稻同屬禾本科植物。

GST基因家族龐大，不同植物中GST基因種類和亞細(xì)胞定位均存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aGST1基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。但Dixon等（2002）研究表明，大多數(shù)GST基因定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)定位于細(xì)胞核。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtGST1（Yang et al.，1998）和鹽角草SbGST（Jha et al.，2011）基因受干旱、高鹽、低溫脅迫等誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。馬立功等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，干旱、高鹽、草酸、核盤(pán)菌及其代謝物均能誘導(dǎo)向日葵HaGSTU1基因表達(dá)上調(diào)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高鹽、高溫、干旱和低氮脅迫處理下高羊茅葉片中FaGST1基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示高羊茅FaGST1基因在干旱、高溫、高鹽和低氮脅迫處理下均出現(xiàn)抑制表達(dá)，推測(cè)高羊茅中FaGST1基因負(fù)向調(diào)控高羊茅逆境脅迫響應(yīng)。該結(jié)論與前人研究結(jié)果存在差異，其原因是GST基因家族龐大復(fù)雜，其編碼蛋白具有多種功能，雖然家族成員間存在功能冗余的現(xiàn)象，但不同成員在不同物種中具有一定的表達(dá)特異性和特定的表達(dá)模式（Sappl et al.，2009）。今后，可通過(guò)構(gòu)建FaGST1基因的過(guò)量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證其調(diào)控功能。

4 結(jié)論

FaGST1基因負(fù)向調(diào)控高羊茅逆境脅迫響應(yīng)，為進(jìn)一步解析高羊茅FaGST1基因的抗性分子機(jī)制和功能特性提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）