郭杰 王瑞雪 郝楠 王吉鴻

[摘 要] ?應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素工藝，利用BBD模型對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量濃度、料液比、超聲時(shí)間和超聲功率等提取參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，選取最優(yōu)條件。結(jié)果表明，超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素最佳工藝條件在乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時(shí)間為49 min，超聲功率為220 W的條件下，黑果枸杞原花青素提取率達(dá)到6.113%。

[關(guān)鍵詞] ?響應(yīng)面法;超聲波;雙水相;黑果枸杞;原花青素

[中圖分類(lèi)號(hào)] ?TQ 914.1 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 1005-0310（2020）04-0085-08

Abstract： Single factor experiment and response surface methodology were used to optimize the ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr.. Five key factors including ethanol volume fraction， ammonium sulfate concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power were selected by one-factor-at-a-time experiments. The results showed that the optimum conditions of ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. were as follows： ultrasonic time for 49 min at 220 W ultrasonic power with 61% ethanol volume and 0.24 g/mL ammonium sulfate， the extraction yield of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. reached 6.113%.

Keywords： Response surface methodology; Ultrasonic; Aqueous two-phase extraction; Lycium ruthenicum Murr.; Proanthocyanidins

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.），茄科枸杞屬多年生灌木，我國(guó)西北荒漠地區(qū)多有分布，具有極強(qiáng)的耐鹽、耐旱、耐堿特性。因其果實(shí)中含有大量的原花青素、多糖、維生素等功能性成分[1]，具有多種有益的生物活性，被稱(chēng)為植物中的“軟黃金”[2-3]。其原花青素的含量遠(yuǎn)高于其他天然植物，清除自由基功效是維生素C的20倍、維生素E的50倍，是自然界最有效的天然抗氧化劑[4-6]。黑果枸杞作為提取原花青素的理想植物，具有廣闊的應(yīng)用空間。

目前，原花青素的提取方法主要集中在有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取、生物酶輔助提取等方面[7]。雙水相萃取因其條件溫和、提取高效、操作簡(jiǎn)單、活性損失小、無(wú)有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)純化和抗生素提取[8-9]，但關(guān)于黑果枸杞原花青素的雙水相萃取工藝研究不多。本研究采用乙醇-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系，用以克服傳統(tǒng)聚合物雙水相體系成本高、分離時(shí)間長(zhǎng)、易乳化、難回收等缺點(diǎn)，并通過(guò)耦合超聲波提高原花青素的提取率，以期為黑果枸杞原花青素工業(yè)化提取提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞購(gòu)于蘭州市藥材市場(chǎng)，自然晾干，干燥密封保存;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于如吉生物科技公司;無(wú)水乙醇、硫酸銨、香草醛、無(wú)水甲醇等購(gòu)于天津精細(xì)化工有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DE超聲波清洗機(jī)：昆山超聲波儀器有限公司;UV-2700紫外分光光度計(jì)：日本島津儀器有限公司;5804R冷凍離心機(jī)：艾本德儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用香草醛-鹽酸法測(cè)定黑果枸杞提取物中原花青素的含量[10]。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶解，分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各標(biāo)準(zhǔn)液1 mL依次加入6.0 mL質(zhì)量濃度為40.0 mg/mL的香草醛-甲醇溶液和3 mL濃鹽酸，混合均勻40 ℃避光反應(yīng)30 min，甲醇為空白對(duì)照，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。

1.3.2 黑果枸杞花青素的提取

黑果枸杞粉碎后過(guò)40目篩，稱(chēng)取1.0 g 黑果枸杞粉末于錐形瓶中，加入一定量的乙醇-硫酸銨，待形成雙水相體系后，放入超聲波清洗器中，在一定的超聲波條件下處理一定的時(shí)間，離心，收集上清液定容形成母液。

1.3.3 原花青素提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確移取母液1.0 mL按1.3.1方法測(cè)定，重復(fù)3 次，取平均值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，按式（1）計(jì)算。

黑果枸杞原花青素提取率：Y（mg/g）=C×V×dM×100%。

（1）式中，C為定容后樣液質(zhì)量濃度（mg/mL）;V為待測(cè)液總體積（mL）;d為稀釋倍數(shù);M為黑果枸杞樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果枸杞原花青素提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g黑果枸杞粉末5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為30 min條件下萃取，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算原花青素提取率。

1.3.4.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g黑果枸杞粉5份，分別加入質(zhì)量濃度為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL的硫酸銨，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶50，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為30 min條件下萃取，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算原花青素提取率。

1.3.4.3 料液比值對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g黑果枸杞粉5份，分別設(shè)置料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為30 min條件下萃取，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算原花青素提取率。

1.3.4.4 超聲功率對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g黑果枸杞粉5份，分別設(shè)置超聲功率為80、120、160、200、240 W，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲時(shí)間為30 min條件下萃取，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算原花青素提取率。

1.3.4.5 超聲時(shí)間對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g黑果枸杞粉5份，分別設(shè)置超聲時(shí)間為15、30、45、60、75、90 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲功率為200 W條件下萃取，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算原花青素提取率。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定了乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量濃度、料液比、超聲功率及超聲時(shí)間為工藝參數(shù)，以原花青素提取率為指標(biāo)，利用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝，評(píng)價(jià)影響多糖得率因素的主效應(yīng)、相互效應(yīng)及因素的二次效應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用完全二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸擬合，計(jì)算原花青素提取率和各實(shí)驗(yàn)因素之間的函數(shù)關(guān)系，見(jiàn)式（2）。Y=A0+3i=1AiXi+3i=1AiiXiXi+2i=13j=i+1AijXiX 。

（2）式中，Y為預(yù)測(cè)的響應(yīng)值，即原花青素提取率;A0 是常數(shù)，Ai 是線(xiàn)性系數(shù)，Aii 是二次方系數(shù)，Aij 是交互作用回歸系數(shù);Xi是自變量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用GraphPad Prism 8.0繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)圖片，采用SPSS 18.0和 Design-Expert 8.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果枸杞原花青素提取率的影響

由香草醛-鹽酸法測(cè)定黑果枸杞提取物中原花青素含量所得的回歸方程：Y=3.165 5X+0.026 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。其中X為原花青素質(zhì)量濃度，Y為樣液在500 nm波長(zhǎng)處的吸光值，該曲線(xiàn)在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，適用于黑果枸杞提取液中原花青素質(zhì)量濃度的計(jì)算。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果枸杞原花青素提取率的影響見(jiàn)圖1。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí)，黑果枸杞原花青素提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì);當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%時(shí)，黑果枸杞原花青素提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵ㄇ嗨厝苡谝掖俭w系，所以開(kāi)始隨著溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高而上升，而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)引起黑果枸杞中的醇溶性物質(zhì)沉淀，從而導(dǎo)致共沉淀現(xiàn)象[11]，上相中原花青素含量降低。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)為最佳提取參數(shù)。

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

圖2表示硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度在0.15～0.25 g/mL范圍時(shí)，原花青素提取率隨硫酸銨質(zhì)量濃度增大而增加，當(dāng)達(dá)到0.25 g/mL時(shí)，原花青素提取率達(dá)到最高，而后，硫酸銨質(zhì)量濃度再增加，原花青素提取率降低。開(kāi)始時(shí)隨硫酸銨用量的增加會(huì)增強(qiáng)雙水相析相作用，提高原花青素的提取率，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，無(wú)機(jī)鹽相增大而有機(jī)相減小，從而降低溶解于有機(jī)相中的原花青素含量[12]。因此，選硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL為最佳的提取參數(shù)。

2.1.3 料液比值對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

料液比對(duì)原花青素提取率的影響如圖3所示，料液比在1∶10到1∶25的范圍內(nèi)，原花青素提取率隨料液比的升高而增加，此后繼續(xù)增加料液比，原花青素提取率不再增高。在一定范圍內(nèi)，溶質(zhì)和溶液的接觸面積隨著料液比的增加而擴(kuò)大，有利于原花青素的溶出[13];但料液比超過(guò)1∶25之后，細(xì)胞內(nèi)外的原花青素已經(jīng)達(dá)到了溶解平衡，已被充分浸提出來(lái)，考慮到提取成本，料液比選擇1∶25作為原花青素提取的最佳提取參數(shù)。

2.1.4 超聲功率對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲時(shí)間為30 min條件下考察超聲功率對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響（圖4）。超聲功率在80 W到200 W的范圍內(nèi)，原花青素提取率隨超聲功率的升高而增加，此后繼續(xù)增加超聲功率，原花青素提取率增高不明顯，考慮到提取成本，超聲功率為200 W作為原花青素提取的最佳提取參數(shù)。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)黑果枸杞原花青素提取的影響

超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響見(jiàn)圖5，提取時(shí)間在20～45 min范圍內(nèi)，原花青素提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)增加迅速;提取時(shí)間超過(guò)45 min以后增加趨勢(shì)不明顯且略有下降。其原因可能是原花青素中的羥基容易被氧化，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，部分原花青素氧化分解[14]，所以在超過(guò)45 min后原花青素提取率會(huì)略有所下降。因此，選45 min為黑果枸杞原花青素最佳的提取時(shí)間。

回歸模型的擬合極顯著（P<0.000 1），實(shí)驗(yàn)復(fù)相關(guān)系數(shù)（R2）是0.891 8和校正測(cè)定系數(shù)（R2adj）是0.805 2，以上結(jié)果均表明模型擬合程度高可靠性強(qiáng)，觀(guān)察值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性良好，在實(shí)驗(yàn)變量范圍內(nèi)具有很高的顯著性，可用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)原花青素的提取條件，此外，低變異系數(shù)（cv）為7.11%表示模型的精度高。以上分析結(jié)果證實(shí)選用的試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，可以用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。表3的結(jié)果顯示模型的一次項(xiàng)E極顯著，D顯著;二次項(xiàng)A2，B2，C2， E2極顯著。所選的各因素水平范圍內(nèi)，超聲功率對(duì)原花青素提取率的影響最為顯著。

根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對(duì)黑果枸杞原花青素提取率的影響相應(yīng)的三維響應(yīng)面和二維等高線(xiàn)如圖6、圖7所示。三維響應(yīng)面闡釋了當(dāng)其他因素保持在零水平不變時(shí)，因變量之間的關(guān)系和兩個(gè)測(cè)試變量之間的相互作用[15]，二維等高線(xiàn)圖的形狀反映了變量之間的交互效應(yīng)，圓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響不顯著，而橢圓輪廓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響顯著[16-17]。由圖6（a）、圖7（a）觀(guān)察可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量濃度交互作用顯著，硫酸銨質(zhì)量濃度軸向等高線(xiàn)密集且變化趨勢(shì)陡峭，乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向等高線(xiàn)較稀疏且變化平緩，表明硫酸銨質(zhì)量濃度比乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響顯著;圖6（b）、6（c）、6（f）和6（h）結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、硫酸銨質(zhì)量濃度與超聲時(shí)間、料液比與超聲時(shí)間交互作用不顯著;但從整體二維等高線(xiàn)圖曲面的變化趨勢(shì)分析，超聲功率顯著影響花青素提取率，這一結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.2 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件分析優(yōu)化黑果枸杞原花青素提取的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為61.2%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.243 5 g/mL，料液比為1∶25.85，超聲時(shí)間為48.58 min，超聲功率為215.6 W。最佳條件下黑果枸杞原花青素預(yù)測(cè)最高提取率為6.147 7%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，兼顧實(shí)際操作的便利性，將上述最佳提取條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時(shí)間為49 min，超聲功率為220 W進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3次平行試驗(yàn)實(shí)際測(cè)得黑果枸杞原花青素提取率為6.113±0.142%，證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性，表明該模型適用于黑果枸杞原花青素的提取。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素的工藝參數(shù)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時(shí)間為49 min，超聲功率為220 W的條件下，黑果枸杞原花青素提取率達(dá)到6.113%，而趙文娟等人應(yīng)用傳統(tǒng)醇提工藝提取黑果枸杞原花青素提取率為4.315%[18]，本研究方法明顯高于趙文娟等人的提取工藝。以上結(jié)果表明超聲波輔助雙水相法是一種可靠高效的原花青素提取方法。

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（責(zé)任編輯 ?李亞青）