馬才奇

（渤海大學(xué)，遼寧 錦州 121013）

靛藍(lán)是一種人工合成色素，廣泛用于食品、醫(yī)藥和印染等行業(yè)[1]。與天然色素相比，合成色素的食用安全性一直是備受爭議的問題[2]。已有文獻(xiàn)研究表明，日落黃、檸檬黃、淡紅色素、麗春紅、喹啉黃及誘惑紅等合成色素嚴(yán)重危害人體健康，已被歐盟等地區(qū)全面禁用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了模擬生理?xiàng)l件下（pH 7.4）靛藍(lán)與BSA 的相互作用機(jī)制及其對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，以期揭示合成色素在生物體內(nèi)的分布、代謝及毒性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

BSA（索萊寶）、靛藍(lán)（麥克林）。F-4500 型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；U-3900 型紫外-可見分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

于10 mL 比色管中加入一定量的BSA 溶液（1.0×10-6mol·L-1），滴加靛藍(lán)溶液（濃度變化范圍為（0～1.0）×10-5mol·L-1）。分別在293、304 和310 K溫度下記錄熒光光譜和紫外光譜。熒光光譜測定條件為：激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長范圍290～600 nm，入射和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。紫外光譜測定條件為：取樣間隔1 nm，波長范圍250～350 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA 與靛藍(lán)作用的熒光光譜

BSA 與不同濃度靛藍(lán)作用的熒光光譜如圖2所示。隨著靛藍(lán)濃度的增加，BSA 的熒光強(qiáng)度降低且略有藍(lán)移，表明靛藍(lán)與BSA 發(fā)生相互作用導(dǎo)致BSA的熒光被猝滅。

圖1 BSA 與靛藍(lán)作用的熒光光譜

動態(tài)猝滅過程可以用Stern-Volmer 方程描述（F0/F= 1 +Kqτ0[Q]= 1 +Ksv[Q]）[4]。以F0/F對[Q]作圖，由曲線斜率得到Stern-Volmer 動態(tài)猝滅常數(shù)（KSV）和動態(tài)猝滅速率常數(shù)（Kq）見表1所示。KSV隨著溫度的升高而降低，且Kq大于最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1，因此推斷靛藍(lán)對BSA 的猝滅非動態(tài)猝滅過程，而應(yīng)該是靜態(tài)猝滅[5]。

表 1 BSA 與靛藍(lán)作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)常數(shù)

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.3 熱力學(xué)參數(shù)

有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)之間常借助靜電作用力、氫鍵、范德華力和疏水作用形成復(fù)合物。依據(jù)反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）可大致判斷作用力類型。ΔH和ΔS可根據(jù)van’t Hoff 方程[7]以lnKA對1/T作圖，由曲線斜率和截距獲得[9]。吉布斯自由能（ΔG）由方程（ΔG=ΔH-TΔS）獲得。靛藍(lán)與BSA 作用的熱力學(xué)參數(shù)見表1。由ΔG、ΔH和ΔS均為負(fù)數(shù)可知靛藍(lán)與BSA 的反應(yīng)過程為自發(fā)進(jìn)行的，作用力主要為范德華力和氫鍵[8]。

圖2 靛藍(lán)與BSA 作用的紫外光譜

2.4 靛藍(lán)與BSA 作用的紫外光譜

BSA 在278 nm 處有吸收峰，是由BSA 分子中氨基酸殘基的芳雜環(huán)的π-π*躍遷引起的[9]。靛藍(lán)與BSA 作用的紫外光譜如圖2所示。隨著靛藍(lán)濃度的增加，BSA 的吸光度增大且略有紅移，說明靛藍(lán)使得氨基酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增加[10]。

3 結(jié)論

采用熒光光譜法和紫外光譜法研究了靛藍(lán)和牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制。熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靛藍(lán)與BSA 主要通過范德華力形成1∶1 復(fù)合物，二者之間具有較強(qiáng)的結(jié)合力。紫外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靛藍(lán)誘導(dǎo)BSA 構(gòu)象發(fā)生改變。