劉倩男，黃偉，丁云花，王亞欽，胡麗萍，趙學(xué)志，何洪巨，劉光敏

青花菜中硫代葡萄糖苷RAA和GBC的近紅外光譜快速測(cè)定

劉倩男1,2，黃偉2，丁云花1，王亞欽1，胡麗萍1，趙學(xué)志1，何洪巨1，劉光敏1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097；2河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北張家口 075000）

【】青花菜是硫代葡萄糖苷含量非常高的十字花科蔬菜，大量醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，青花菜具有防癌抗癌的顯著功效，其防癌抗癌特性主要與硫代葡萄糖苷的多種降解產(chǎn)物有關(guān)，尤其是4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）和3-甲基吲哚基硫苷（GBC）的降解產(chǎn)物。本研究擬建立青花菜抗癌硫代葡萄糖苷的近紅外光譜快速測(cè)定方法。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定青花菜中硫代葡萄糖苷RAA和GBC的含量，將近紅外光譜儀掃描樣品所獲得的光譜文件與化學(xué)分析結(jié)果在偏最小二乘回歸法（partial least squares，PLS）分析的基礎(chǔ)上，采用不同的散射處理方式（SNV、Detrend、SNV+Detrend）和導(dǎo)數(shù)處理方式（FD、SD）對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，從而得到定標(biāo)方程，再進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）和3-甲基吲哚基硫苷（GBC）是青花菜中存在的主要硫苷，占總含量的60%以上。90份青花菜的硫苷組分含量結(jié)果表明RAA平均含量最高，含量變化范圍最大，平均含量為6.20 μmol?g-1，變化范圍為0.66—14.54 μmol?g-1；GBC平均含量為4.43 μmol?g-1，變化范圍為0.25—10.79 μmol?g-1。經(jīng)過(guò)篩選，采用SNV+SD處理后RAA預(yù)測(cè)模型的校正集和預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)分別為0.867和0.912；采用SNV+SD處理后的GBC預(yù)測(cè)模型的校正集和預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)分別為0.918和0.960。建立了RAA和GBC的近紅外光譜快速檢測(cè)模型，為青花菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的快速檢測(cè)、優(yōu)異抗癌青花菜種質(zhì)資源的快速篩選與利用奠定了基礎(chǔ)。

青花菜；硫代葡萄糖苷；4-甲基硫氧丁基硫苷；3-甲基吲哚基硫苷；近紅外光譜；快速測(cè)定

0 引言

【研究意義】青花菜（var）又名綠菜花、西蘭花，為十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，以主莖及側(cè)枝頂端形成的綠色花球?yàn)楫a(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)豐富，色、香、味俱佳，是國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)十分暢銷的一種蔬菜。青花菜含有較高的維生素C、硒等營(yíng)養(yǎng)成分和豐富的植物活性物質(zhì)（Bioactive substances）。植物活性物質(zhì)是天然存在且含量較少的一類具有抗氧化、抗病、抗突變、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)或其他生理活性的化學(xué)物質(zhì)，如硫代葡萄糖苷、黃酮類、類胡蘿卜素、萜烯類化合物等。十字花科植物的主要活性成分為硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GS，簡(jiǎn)稱硫苷），硫苷是一類含硫化合物，是十字花科植物中特有的次生代謝產(chǎn)物[1-3]。硫苷的核心結(jié)構(gòu)是-D-葡萄糖連接一個(gè)磺酸鹽醛肟基團(tuán)和一個(gè)來(lái)源于氨基酸的側(cè)鏈，根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同把硫苷分為吲哚類、脂肪類和芳香類硫苷[4]。青花菜是硫代葡萄糖苷含量非常高的十字花科蔬菜，所含硫苷的種類至少有8種，其中4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）和3-甲基吲哚基硫苷（GBC）是主要的硫苷，占總含量的60%以上。大量醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，青花菜具有防癌抗癌的顯著功效[5-8]，而其具有的防癌抗癌特性正是與硫代葡萄糖苷的多種降解產(chǎn)物有關(guān)，尤其是具有很強(qiáng)抗癌功效的RAA降解產(chǎn)物萊菔硫烷和GBC的降解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇[9-11]。不同青花菜品種中RAA以及GBC含量存在較大差異。因此在青花菜的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)育種方面，對(duì)青花菜中活性成分硫苷的準(zhǔn)確快速測(cè)定以及培育高含量RAA和GBC青花菜品種尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近紅外光譜（Near infrared reflectance spectroscopy，簡(jiǎn)稱NIRs）分析技術(shù)可通過(guò)測(cè)定樣品的近紅外吸收光譜，達(dá)到同時(shí)分析樣品中多種成分的效果。雖然我國(guó)對(duì)近紅外光譜技術(shù)的研究及應(yīng)用起步較晚，但因其快速、無(wú)損傷、分析費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，NIRs技術(shù)在農(nóng)業(yè)、石油化工、制藥與臨床醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)等領(lǐng)域均已得到廣泛應(yīng)用[12-15]。JHA等[16]應(yīng)用便攜式近紅外設(shè)備采集西紅柿汁的光譜，對(duì)其酸度和糖度值進(jìn)行建模和預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，隨著波長(zhǎng)的增加，其校正標(biāo)準(zhǔn)偏差和預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差減?。籔EDRO等[17]建立了西紅柿的總固形物、可溶性固形物、番茄紅素和其他種類胡蘿卜素含量的近紅外光譜模型，模型的相關(guān)系數(shù)較好；覃方麗等[18]通過(guò)對(duì)不同品種和顏色的鮮辣椒凸表面點(diǎn)的近紅外光譜進(jìn)行分析，建立了較為可靠的可溶性糖和Vc含量的預(yù)測(cè)模型；王多加等[19]利用傅里葉變換近紅外光譜儀建立了小白菜和菜心全植株、完整葉片和剁碎葉片中硝酸鹽的無(wú)損快速測(cè)定準(zhǔn)確模型，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相關(guān)系數(shù)較高；金同銘等[20]運(yùn)用近紅外光譜分析儀篩選出蘋果中蔗糖、葡萄糖、果糖和蘋果酸的特征波長(zhǎng)，建立了這4種組分的定標(biāo)方程，其對(duì)樣品的預(yù)測(cè)值和高效液相色譜法測(cè)定值的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，從而證實(shí)了近紅外光譜分析可滿足實(shí)際應(yīng)用中蘋果糖、酸含量的測(cè)定精度。近紅外光譜技術(shù)在硫苷的快速檢測(cè)方面也有一些文獻(xiàn)報(bào)道，如芥菜種子[21]、芥藍(lán)[22]。王耐紅等[23]運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜硫苷組分的含量進(jìn)行了檢測(cè)；賀啟川等[24]應(yīng)用近紅外光譜建立了一種快速測(cè)定油菜硫苷的模型；郭澤慧[25]完成了蘿卜硫苷組分近紅外定標(biāo)模型的構(gòu)建?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】硫苷的測(cè)定方法包括HPLC測(cè)定完形硫苷和脫硫硫苷，以及HPLC/MS分析完形硫苷，但是存在分析周期長(zhǎng)或耗費(fèi)高等問(wèn)題。現(xiàn)在近紅外光譜分析技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快速、無(wú)損、多組分檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在果蔬營(yíng)養(yǎng)和安全品質(zhì)檢測(cè)上有極大的應(yīng)用潛力。青花菜作為一種大宗食用的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值蔬菜，在膳食結(jié)構(gòu)中有重要地位，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和抗癌組分的快速檢測(cè)研究很有必要。目前還沒(méi)有利用近紅外光譜技術(shù)測(cè)定青花菜中抗癌硫苷組分的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定青花菜中硫苷的組成和含量，在近紅外光譜儀掃描樣品所獲得的光譜文件與HPLC測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇不同散射處理和導(dǎo)數(shù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理，選用最佳組合預(yù)處理方法創(chuàng)建近紅外光譜模型，并經(jīng)外部檢驗(yàn)確認(rèn)。該方法為青花菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的快速無(wú)損檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)的青花菜種質(zhì)資源由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。樣品于2018年3月11日播種，4月16日定植于蔬菜中心四季青農(nóng)場(chǎng)。6月10日當(dāng)青花菜花球長(zhǎng)到收獲標(biāo)準(zhǔn)時(shí)分期收獲。共選取90個(gè)不同青花菜的花球，取代表性的小花球5—10個(gè)，切割混勻，使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理2 d，再將凍干后的樣品粉碎并過(guò)篩（60目），制得均勻的干粉樣品，低溫（-20℃）保存，用于定標(biāo)模型的建立。

用于模型驗(yàn)證的30份樣品來(lái)源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心通州基地，于2018年10月20日收獲，處理方法同上。

1.2 儀器試劑

試驗(yàn)所用主要儀器：SZJY-117電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Pilot10-15M真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；XDS近紅外光譜儀，F(xiàn)OSS公司；LC-20AD高效液相色譜儀，SHIMADZU公司；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

試劑主要有：甲醇（Fisher Chemical公司），DEAE膠（GE Healthcare公司），NaAc溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），硫酸酯酶（Sigma公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硫苷的提取與分析 稱取凍干樣品0.2 g，放入15 mL塑料管中。加入內(nèi)標(biāo)苯甲基硫苷（TRO）0.25 mL，加入100%預(yù)熱的甲醇5 mL，80℃下水浴20 min，每隔4—5 min渦旋振蕩1次，3 000 r/min離心10 min，取上清液倒入15 mL塑料管中。沉淀物繼續(xù)用70%甲醇提取2次，同上述處理方法，合并上清液，即為樣品液。取一次性注射器，加入玻璃棉，塞緊，放在試管上。加入DEAE膠溶液2 mL，用2 mL雙蒸水洗滌，加入樣品液2 mL。待樣品液不再滴下，加入 0.02 mol?L-1NaAc溶液。待不再有液體滴下，將注射器轉(zhuǎn)移到另一試管上，加入75 μL硫酸酯酶溶液，封口過(guò)夜。將過(guò)夜的注射器用雙蒸水洗滌3次，每次0.5 mL。用注射頭擠壓注射器，使液體盡可能轉(zhuǎn)移到試管中。將試管中液體通過(guò)0.45 μm濾膜轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶中，冷凍保存，待用。取1 mL上清液進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，記錄峰面積。利用內(nèi)標(biāo)和響應(yīng)因子計(jì)算硫苷含量[26]，硫苷含量計(jì)算公式如下：

硫苷含量=脫硫硫苷峰面積×內(nèi)標(biāo)量×脫硫硫苷相對(duì)響應(yīng)因子內(nèi)標(biāo)峰面積×試樣質(zhì)量

1.3.2 近紅外光譜儀分析 近紅外儀器開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min，進(jìn)行光譜和噪聲診斷，當(dāng)診斷結(jié)果通過(guò)后方可開(kāi)始掃描。將樣品干粉均勻平鋪在樣品杯中，用蓋子壓實(shí)，保證樣品覆蓋均勻，然后對(duì)樣品進(jìn)行靜態(tài)掃描，每個(gè)樣品掃描3次。將HPLC方法得到硫苷含量輸入儀器配套的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件，進(jìn)行光譜分析處理。在偏最小二乘回歸法分析的基礎(chǔ)上，采用不同散射處理方式（SNV、Detrend、SNV+Detrend）和導(dǎo)數(shù)處理方式（FD、SD）對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析預(yù)處理，得到校正模型，然后通過(guò)驗(yàn)證集對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。應(yīng)用近紅外光譜儀配套的WinISI III定標(biāo)軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 青花菜品種資源硫苷組成和含量

用高效液相色譜法測(cè)定青花菜硫代葡萄糖苷?qǐng)D譜如圖1所示，青花菜硫代葡萄糖苷組分在30 min內(nèi)全部出峰，分離較為完全，共檢測(cè)到8種硫苷，包括脂肪類、芳香類和吲哚類硫苷，按照出峰順序分別為2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）、4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）、3-丁烯基硫苷（NAP）、4-羥基吲哚基-3甲基硫苷（4OH）、4-甲硫基丁烯基硫苷（ERU）、3-甲基吲哚基硫苷（GBC）、4-甲基吲哚基-3甲基硫苷（4ME)、1-甲基吲哚基-3甲基硫苷（NEO）。其中4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）和3-甲基吲哚基硫苷（GBC）是青花菜中存在的主要硫苷，約達(dá)到總含量的60%。

1：2-羥基-3-丁烯基硫苷 PRO；2：4-甲基硫氧丁基硫苷RAA；3：3-丁烯基硫苷NAP；4：4-羥基吲哚基-3甲基硫苷4OH；5：苯甲基硫苷 TRO；6：4-甲硫基丁烯基硫苷 ERU；7：3-甲基吲哚基硫苷GBC；8：4-甲基吲哚基-3甲基硫苷4ME；9：1-甲基吲哚基-3甲基硫苷NEO

試驗(yàn)所用材料為本中心青花菜育種課題組的青花菜種質(zhì)資源和品種，樣品覆蓋各種不同基因型，包括日本、歐洲、美國(guó)等不同來(lái)源的材料和品種，生育期有早熟、中熟、晚熟不同類型，株型有直立和半直立、有主球和分枝型，花球有緊實(shí)型和松散型，花蕾有細(xì)粒、中粒和粗粒，具有廣泛代表性。這些樣品的硫苷組分含量結(jié)果見(jiàn)表1，RAA和GBC是最主要的兩種硫苷，其中RAA平均含量為6.20 μmol?g-1，變化范圍為0.66—14.54 μmol?g-1，GBC平均含量為4.43 μmol?g-1，變化范圍為0.25—10.79 μmol?g-1。通過(guò)這個(gè)結(jié)果可以看出，選取的樣品中RAA和GBC成分含量分布范圍較廣，能很好地代表不同含量RAA和GBC的青花菜樣品，適于做建立近紅外模型的樣品集。

表1 青花菜樣品中硫代葡萄糖苷組分含量

2.2 青花菜近紅外光譜分析

使用近紅外光譜儀對(duì)90個(gè)青花菜樣品進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品掃描3次，所得到的近紅外原始光譜除樣品自身信息外，還包含了其他大量無(wú)關(guān)信息和噪聲，采用不同散射處理方式和導(dǎo)數(shù)處理方式對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，減弱甚至消除各種非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響，凈化譜圖信息，為校正模型的建立奠定基礎(chǔ)。導(dǎo)數(shù)處理可有效地提高光譜的分辨率、減小基線漂移、消除光譜的譜峰重疊[27-28]，在實(shí)際分析中一般采用一階導(dǎo)數(shù)（FD）和二階導(dǎo)數(shù)（SD）來(lái)進(jìn)行光譜預(yù)處理。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）主要是用來(lái)消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對(duì)NIR漫反射光譜的影響，去散射處理（Detrend）是一種用來(lái)消除漫反射光譜的基線漂移光譜處理方法，通常與SNV聯(lián)合使用（SNV+Detrend）[29]。

圖2為青花菜樣品經(jīng)近紅外光譜分析儀得到的近紅外原始光譜圖，其中橫坐標(biāo)代表光譜波長(zhǎng)（nm），縱坐標(biāo)為青花菜樣本的吸光度，對(duì)其分析可知青花菜樣品在400—1 092 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有明顯的吸收峰和基本相同的變化趨勢(shì)，說(shuō)明青花菜樣品的吸光度與其化學(xué)成分含量之間存在相關(guān)性，有利于近紅外模型的建立。圖3為原始光譜經(jīng)過(guò)SNV+Detrend+FD處理后的光譜曲線圖，與原始光譜相比，處理過(guò)的光譜曲線起伏更加顯著，峰變得更多更尖銳，一些原本平滑的部分也出現(xiàn)了吸收峰。圖4為原始光譜經(jīng)過(guò)SNV+Detrend+SD處理后的光譜曲線圖，明顯出現(xiàn)擬合的現(xiàn)象。

2.3 青花菜硫代葡萄糖苷組分的分析

在利用偏最小二乘回歸法（partial least squares，PLS）分析的基礎(chǔ)上，采用8種數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行處理，比較結(jié)果所得參數(shù)，確定最合適的處理方法，RSQ是定標(biāo)相關(guān)系數(shù)，1-VR是內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)，都是越接近于1越好。由表2和表3可知，RAA內(nèi)部交叉檢驗(yàn)效果較好，經(jīng)過(guò)SNV+SD處理后的RSQ和1-VR值分別為0.867和0.846，GBC經(jīng)過(guò)SNV+SD處理后的相關(guān)系數(shù)RSQ和1-VR值分別達(dá)到0.912和0.892。結(jié)果表明，該方法用于預(yù)測(cè)青花菜中RAA和GBC的含量切實(shí)可行。

2.4 青花菜硫代葡萄糖苷組分的近紅外光譜模型的建立

2.4.1 青花菜硫代葡萄糖苷組分中RAA的近紅外光譜模型建立 通過(guò)表2中不同的建模效果對(duì)比，采用SNV+SD處理后的模型效果較好，SNV+Detrend+SD效果次之，相關(guān)系數(shù)為0.859，內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.844；Detrend+FD的相關(guān)系數(shù)為0.794，內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.788，效果最差。因此將SNV+SD處理作為預(yù)處理方法，對(duì)青花菜硫代葡萄糖苷中RAA組分進(jìn)行建模。建模后的效果如圖5所示，該效果圖能夠直觀地體現(xiàn)出模型的預(yù)測(cè)效果，樣品無(wú)規(guī)律地分布在直線兩側(cè)的區(qū)域，整體呈均勻離散的趨勢(shì)，沒(méi)有出現(xiàn)大的偏差，說(shuō)明模型較準(zhǔn)確，可以用于青花菜中RAA含量的預(yù)測(cè)。

圖2 青花菜近紅外原始光譜

圖3 SNV+Detrend+FD處理后光譜圖

2.4.2 青花菜硫代葡萄糖苷組分中GBC的近紅外光譜模型建立 由表3可以看出，采用SNV+FD處理后的模型效果最好。SNV+Detrend+SD效果次之，相關(guān)系數(shù)為0.899，內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.887，Detrend+SD的相關(guān)系數(shù)為0.841，內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.862，效果最差。因此采用SNV+FD對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，然后對(duì)青花菜硫代葡萄糖苷中GBC組分進(jìn)行建模，建模后的效果如圖6所示，模型較準(zhǔn)確，該模型可以用于青花菜硫代葡萄糖苷中GBC組分的快速預(yù)測(cè)實(shí)踐中，實(shí)現(xiàn)高效篩選。

圖4 SNV+Detrend+SD處理后的光譜

表2 不同處理方法對(duì)青花菜中RAA組分定標(biāo)方程的對(duì)比

表3 不同處理方法對(duì)青花菜中GBC組分定標(biāo)方程的對(duì)比

圖5 RAA模型效果圖

Lab是化學(xué)方法檢測(cè)數(shù)據(jù)，NIR是近紅外快速預(yù)測(cè)數(shù)據(jù) Lab is the test data of chemical method, NIR is the fast prediction data of near infrared

2.5 模型驗(yàn)證與分析

基于已建立的模型，隨機(jī)選擇20個(gè)與建模樣品無(wú)關(guān)的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，使用HPLC測(cè)得的樣品含量等理化指標(biāo)，然后使用已建立的模型對(duì)這些樣品中RAA和GBC含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表4所示。通過(guò)驗(yàn)證集進(jìn)行外部檢驗(yàn)可以看出，預(yù)測(cè)青花菜蔬菜粉樣品中RAA含量的外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.918，預(yù)測(cè)GBC含量的外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.960，RAA的檢驗(yàn)偏差較低（0.143）；GBC的檢驗(yàn)偏差僅有0.064，模型效果較好，因此可以使用此模型來(lái)快速預(yù)測(cè)青花菜蔬菜粉原料中RAA和GBC的含量。

3 討論

青花菜作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的蔬菜，在東西方膳食結(jié)構(gòu)中占有重要的地位。青花菜含有的蘿卜硫素前體物質(zhì)RAA的抗癌作用已經(jīng)有大量研究文獻(xiàn)[1-2,5-7]。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員最新發(fā)現(xiàn)青花菜中含有的活性物質(zhì)GBC的降解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇（I3C）可以有效抑制E3泛素連接酶（WWP1）的功能來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中PTEN的活化，從而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[30]。因此，篩選和培育抗癌硫苷含量高的品種已經(jīng)成為青花菜品質(zhì)育種的重要目標(biāo)。

硫苷的分析方法包括HPLC技術(shù)測(cè)定完形和脫硫硫苷，以及HPLC/MS技術(shù)測(cè)定完形硫苷，可以準(zhǔn)確定性和定量，但是存在花費(fèi)較高（HPLC-MS）、分析時(shí)間長(zhǎng)（HPLC）等缺點(diǎn)，限制了大量育種材料的及時(shí)篩選和評(píng)價(jià)。近紅外光譜法是根據(jù)樣品內(nèi)有機(jī)官能團(tuán)（OH、CH、NH、SH）的自身振動(dòng)吸收近紅外光譜區(qū)相應(yīng)波長(zhǎng)的能量，從而產(chǎn)生能量的躍遷在光譜中表現(xiàn)出來(lái)[13]。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用、化學(xué)計(jì)量學(xué)研究的深入以及近紅外光譜儀器制造技術(shù)的完善，NIRs分析技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域特別是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

近紅外光譜分析技術(shù)不同于其他常規(guī)分析技術(shù)，采用間接校正方法，通過(guò)建立校正模型來(lái)預(yù)測(cè)未知樣品成分，分析結(jié)果受代表性樣品的選擇、近紅外光譜準(zhǔn)確性等眾多因素的影響[31]。任何能夠?qū)颖镜墓庾V數(shù)據(jù)及測(cè)量數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響的因素，都有可能影響到所建模型的質(zhì)量。近紅外光譜分析技術(shù)的關(guān)鍵是建立一個(gè)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)的校正分析模型，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定性或定量分析[32]。

標(biāo)準(zhǔn)分析方法提供的化學(xué)測(cè)定值作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參與近紅外模型的創(chuàng)建，其準(zhǔn)確性對(duì)于建立一個(gè)優(yōu)質(zhì)可靠的模型至關(guān)重要[33]。本研究首先對(duì)90份青花菜品種資源樣品進(jìn)行了HPLC硫苷種類與含量的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫苷的含量在品種間的差異很大，RAA含量為0.66—14.54 μmol?g-1，GBC含量為0.25—10.79 μmol?g-1。不僅為品質(zhì)育種提供了篩選材料，同時(shí)為近紅外模型建立提供了有效數(shù)據(jù)和保證。

在光譜信息處理過(guò)程中，采用不同散射處理方式和導(dǎo)數(shù)處理方式對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響，提高光譜呈現(xiàn)的準(zhǔn)確性，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化光譜范圍，選擇對(duì)樣品信息反映突出的光譜區(qū)域，篩選出最有效的光譜區(qū)域，為建立近紅外光譜模型奠定基礎(chǔ)。本研究使用青花菜的硫苷種類中，RAA和GBC是抗癌效果最好的活性物質(zhì)，預(yù)測(cè)模型RAA的相關(guān)系數(shù)為0.918，GBC的相關(guān)系數(shù)為0.960，分析時(shí)間短，可在半分鐘內(nèi)完成。研究結(jié)果表明NIRs能夠很好地應(yīng)用于大量青花菜育種材料資源的快速篩選。另外，幾種硫苷的含量相關(guān)系數(shù)小于0.6，是否和含量較低或與模型的選擇和優(yōu)化等方面有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

對(duì)于青花菜硫代葡萄糖苷中4-甲基硫氧丁基硫苷（RAA）和3-甲基吲哚基硫苷（GBC）指標(biāo)采用SNV+SD處理后的模型效果較好。利用近紅外光譜檢測(cè)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)青花菜干粉樣品中硫代葡萄糖苷含量的快速無(wú)損預(yù)測(cè)，具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、方法快捷、預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為青花菜品質(zhì)指標(biāo)的快速檢測(cè)提供了切實(shí)可行的技術(shù)參考，還可用于青花菜的育種實(shí)踐當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)青花菜育種材料快速高效的篩選。

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Rapid Determination of RAA and GBC in Broccoli by Near Infrared Spectroscopy

LIU QianNan1, 2, HUANG Wei2, DING YunHua1, WANG YaQin1, HU LiPing1, ZHAO XueZhi1,HE HongJu1, LIU GuangMin1

(1Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097;2College of Agricultural and Forestry Science and Technology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei)

【】Broccoli is a cruciferous vegetable with high glucosinolates content. A large number of medical and nutritional studies have shown that regular consumption of broccoli can effectively reduce the incidence of a variety of cancers. It has been confirmed that the anticancer characteristics of broccoli are mainly related to the degradation products of glucosinolates, especially the degradation products of 4-methylthiobutyl-thioglucoside (RAA) and 3-methylindolythioglucoside (GBC). The aim of this study was to establish a rapid method for the determination of anticancer glucosinolates in broccoli by near infrared spectroscopy.【】In this study, the content of RAA and GBC in broccoli was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Based on the partial least squares (PLS), the spectral files obtained by NIRS scanning and chemical analysis results were progressed by different scattering methods (SNV, detrend, and SNV + detrend) and different derivative treatment (FD and SD). After the spectral data were preprocessed, the calibration equation was obtained and the model was verified.【】RAA and GBC were the main glucosinolates in broccoli, accounting for more than 60% of the total content. The results of 90 broccoli samples showed that the average content of RAA was the highest, the range of change was the largest, the average content was 6.20 μmol?g-1, and the range of change was 0.66-14.54 μmol?g-1; the average content of GBC was 4.43 μmol?g-1, and the range of change was 0.25-10.79 μmol?g-1. After screening, the correlation coefficients of calibration set and prediction set of RAA prediction model with SNV + SD treatment were 0.867 and 0.912, respectively; the correlation coefficients of calibration set and prediction set of GBC prediction model using SNV + SD treatment were 0.918 and 0.960, respectively. 【】In this study, the rapid detection model of RAA and GBC was established, which laid a foundation for the rapid detection of the nutritional quality of broccoli and the rapid detection and utilization of superior broccoli germplasm resources.

broccoli; glucosinolates; 4-methylsulfonylbutyl-glucosinolate; 3-indolylmethyl-glucosinolate; near infrared spectroscopy; rapid determination

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.21.017

2020-03-09；

2020-04-20

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFE0114500-4）、北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QNJJ201734）、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)基金（KJCX20180206）

劉倩男，E-mail：1367194814@qq.com。通信作者劉光敏，Tel：010-51503060；E-mail：liuguangmin@nercv.org

（責(zé)任編輯 趙伶俐）