蔣雅茜，胡文鋒，李 昕，楊靜蕓，劉怡君，全沁果

（1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州 425100；2.湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425100；3.湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南永州 425100）

0 引言

食品行業(yè)每年由腐敗變質(zhì)造成的經(jīng)濟(jì)損失接近20%[1]，因此，食品的防腐保鮮在食品流通與儲藏過程中備受重視。添加食品防腐劑是控制食品劣變的有效手段之一，其效果理想且成本合理，根據(jù)其來源不同可歸為化學(xué)防腐劑和天然防腐劑兩類[2]?；瘜W(xué)防腐劑是目前防腐劑產(chǎn)品中的主流，其中亞硝酸鹽是最具代表性的一類，但已證實(shí)亞硝酸鹽在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為具有致癌性的亞硝胺[3]。天然防腐劑在發(fā)揮防腐功能的同時(shí)，不僅不會產(chǎn)生對人體健康具有危害的代謝產(chǎn)物，還能為人體提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)，近年來受到了消費(fèi)者的追捧[4]。目前，天然防腐劑主要取材于動物、植物和微生物等[5]。其中，來源于植物的天然防腐劑由于其資源廣闊、分離過程簡單、純度高等特點(diǎn)受到了更多的關(guān)注。若將天然防腐劑取材于農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，在保持天然防腐劑上述優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)又可縮小與化學(xué)防腐劑相比的成本劣勢，則具有更高的市場價(jià)值。

江永香柚是湖南省永州市江永縣經(jīng)移栽的特有沙田柚品種，和香芋、香姜、香米、香菇并稱“江永五香”，種植面積較大，每年有大量柚皮被隨意丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。近年來，江永香柚皮、籽中的揮發(fā)油、多糖、檸檬苦素等成分得到了科研人員的關(guān)注，但其具體活性以及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究[7-9]。而該過程需要重點(diǎn)考慮提取活性成分技術(shù)路線的放大難度，亦要權(quán)衡企業(yè)對開發(fā)成本的接受能力。為此，本文擬通過響應(yīng)面法建立江永香柚皮水提參數(shù)與提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）抑制作用的模型，并將其應(yīng)用到液體食品中考察其實(shí)際抑菌效果，可為開發(fā)液體食品天然防腐劑的選材提供一種新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

江永香柚皮（周邊集市收集，經(jīng)洗凈后自然晾干，于60 ℃下干燥至恒重，粉碎過篩后密封儲存）；S.aureus，本校微生物試驗(yàn)室保存；鹽水溶液，0.15 mol/L的NaCl；酸梅湯、純牛奶、橙汁、黃豆醬、食用油購于永州市零陵區(qū)河西菜市場，珍珠奶茶購于湖南科技學(xué)院周邊奶茶店；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯基料，購自環(huán)凱微生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、PHS-3C精密pH計(jì)（大連中匯達(dá)科技儀器有限公司）、DZF-6051型真空干燥箱（上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司）、WG-71 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、SW-CJ-2潔凈工作臺（蘇州安泰空汽技術(shù)有限公司）、FZ-102 植物粉碎機(jī)（上海勝啟儀器儀表有限公司）、HWS 智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司），DT5-6A型臺式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 S.aureus培養(yǎng)物的制備

在無菌條件下挑取適量S.aureus接入50 mL經(jīng)滅菌的營養(yǎng)肉湯，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。在200 r/min下培養(yǎng)12 h后，將所得物于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，將其經(jīng)無菌生理鹽水洗滌2次后制備成約109cfu/mL的菌懸液備用。

1.3.2 抑菌活性的測定

將干凈的濾紙經(jīng)打孔器統(tǒng)一制成直徑約4 mm的圓片，滅菌后分別將其置于提取液和蒸餾水中浸泡30 min，瀝去多余的試液后用無菌鑷子夾至涂好菌液的培養(yǎng)基平板上（100 μL菌懸液），每個(gè)處理組按“+”形對稱放置4張濾紙片（平行3次，外加空白對照），于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，采用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量和計(jì)算抑菌圈大小R（扣除濾紙片及空白直徑）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

提取的條件為超聲時(shí)間10 min、提取溫度30 ℃、料液比1:10、粒徑20目。在此基礎(chǔ)上依次研究超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（30、35、40、45、50 ℃）、粒徑（20、40、60、80、100目）和料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）4個(gè)單因素的改變對柚皮水提取物抑菌效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抑菌圈大小為響應(yīng)值，選取影響較大的3個(gè)因素超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）和料液比（X3）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以對S.aureus的抑菌圈大?。≧）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，并驗(yàn)證最佳工藝條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 提取物對不同液體食品中S.aureus的抑制作用

分別移取 S.aureus菌懸液 1、2、3、4、5 mL，用經(jīng)滅菌的生理鹽水溶液逐個(gè)定容至100 mL容量瓶中，研究江永香柚皮水提物不同用量對鹽水溶液（pH 7.0）中S.aureus致死率的變化，進(jìn)而確定最適用量。分別移取1 mL S.aureus菌懸液和1.3.4中得到的最適用量的江永香柚皮水提物加入到不同液體食品中（共100 mL體系），對照組中添加1 mL S.aureus菌懸液和等量的無菌水，搖勻后于37 ℃下恒溫培養(yǎng)。每隔1、2、4、8 h取樣檢測，計(jì)數(shù)方法參考 GB 4789.2-2010[10]，采用細(xì)菌致死率S評價(jià)各體系的抑菌效果：lgS=lg（N/N0）（N、N0分別表示處理后和處理前S.aureus菌落的總數(shù)（CFU/mL）[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)組均平行3次，取其平均值。利用Origin 8.0和Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1（a）知，江永香柚皮水提物的抑菌效果受超聲時(shí)間變化的影響最為顯著，總體上呈先升后降趨勢。超聲時(shí)間為30 min時(shí)，水提物的抑菌效果最好。此時(shí)其對S.aureus的抑菌圈為13.21 mm，相對于10 min抑菌效果提高約40.38%。而當(dāng)超聲時(shí)間延長至50min時(shí)，其抑菌效果約為30 min的84.33%。超聲作用能提升破壁效果而促進(jìn)抑菌成分的溶出，但超聲時(shí)間過長則會使得抑菌成分的分解效率大于其溶出效率[13]。由圖1（b）知，在30～50 ℃的處理組中，當(dāng)控制超聲溫度為40 ℃時(shí)水提物的抑菌能力最強(qiáng)，其對S.aureus的抑菌圈為10.94 mm；當(dāng)溫度升高至50 ℃后，水提物的抑菌效果明顯下降，抑菌圈大小僅為8.92 mm，可能是過高的溫度使得江永香柚皮水提物中的抑菌成分受熱分解和構(gòu)象改變[14]。由圖1（c）知，粒徑的變化對江永香柚皮水提物抑菌效果的影響較小，當(dāng)粒徑達(dá)到40目以后，其抑菌圈的變化無顯著差異。因此，確定江永香柚皮提取水溶性抑菌成分的最適粒徑為40目。

由圖1（d）知，料液比達(dá)到1:15 g/mL時(shí)，繼續(xù)增加液料比無助于抑菌效果的提升；超過1:20 g/mL后，江永香柚皮水提物抑菌效果的下降程度變得顯著，其抑菌圈最低時(shí)僅為8.24 mm。加水過少使得提取過程中的有效成分的溶出效率不充分，江永香柚皮抑菌成分不能完全溶出，而料液比過高減少提取溶劑與原料的碰撞頻率，還會造成資源浪費(fèi)，且對后續(xù)分離純化步驟不利[15]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

固定樣品的粒徑為40目，選取超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表2可知，采用Design expert 8.0.6軟件計(jì)算得到抑菌圈（R）對超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

2.3 回歸模型方差分析

回歸模型方差分析結(jié)果（見表3）可知，模型的 F=48.25、P=0.000 1，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.923 0，差異不顯著，說明試驗(yàn)誤差在可接受范圍內(nèi)；校正系數(shù)R2=0.936 2，說明響應(yīng)值的變化有93.62%來源于所選因素，即來源于X1、X2、X3，顯示模型較為可信；變異系數(shù)（CV）僅為3.41%，說明模型有良好的重現(xiàn)性。響應(yīng)面模型中一次項(xiàng)X1及其二次項(xiàng)X12、X22達(dá)到極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)X32達(dá)到顯著（P＜0.05），其余各項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。各因素對抑菌圈大小的影響大小為：X1（超聲時(shí)間）＞X2（超聲溫度）＞X3（料液比）。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的3D響應(yīng)面圖見圖2，曲面的陡峭程度反映了操作條件改變下響應(yīng)值敏感性的大小[16]，結(jié)合回歸模型分析知，交互因子對提取物抑菌效果的影響不明顯。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過Design-expert 8.0.6軟件擬合得到最適工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間28.19 min，超聲溫度為39.04 ℃，料液比為 1：15.33 g/mL，預(yù)測抑菌圈大小為15.288 7 mm。結(jié)合現(xiàn)實(shí)中工藝放大的實(shí)際需求，最終工藝定為：超聲時(shí)間28 min，超聲溫度39 ℃，料液比為1：15 g/mL，粒徑為40目。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)4次，與取消超聲輔助提取的試驗(yàn)組進(jìn)行對照，結(jié)果見表4和圖3。

表4 提取物的抑菌圈大小

2.5 提取物抑菌條件的確定

圖4顯示了S.aureus的致死率在鹽水溶液中隨香柚皮水提物用量增加及處理時(shí)間延長的變化規(guī)律。S.aureus在鹽水體系中的致死率隨提取物用量的增加和處理時(shí)間的延長而提升，當(dāng)提取物用量達(dá)到3 mL和處理時(shí)間超過25 min后，S.aureus致死率的變化基本穩(wěn)定，由此確定香柚水提物最適用量為3 mL，最適處理時(shí)間為25 min。

2.6 提取物對不同液態(tài)食品中S.aureus的抑制作用

相對于空白（每個(gè)樣品組下欄），江永香柚皮水提物對6種不同食品中接種的S.aureus均存在一定抑制作用（具體見表5）。向各樣品中加入江永香柚皮水提物后發(fā)現(xiàn)，抑菌能力因食品體系不同而差異顯著。在奶茶、酸梅湯、食用油、橙汁等固形物含量低的液體食品中其抑菌效果較好，接種至對應(yīng)體系中S.aureus菌落總數(shù)的抑制能力接近或超過3個(gè)數(shù)量級。而在固形物含量較高的牛奶和黃豆醬中抑制效果較差，分別只減少了0.85和1.78個(gè)數(shù)量級，原因可能是江永香柚皮水提物在固形物含量高的液態(tài)食品中不易擴(kuò)散所致。

表5 各種液體食品中水溶性抑菌成分對S.aureus的抑制率比較

3 結(jié)語

柚皮中被證實(shí)具有抑菌活性的功能性成分以多糖、黃酮和精油為主[17-19]。其中水溶性抑菌成分所占比重較高，且開發(fā)成本較低。超聲波輔助法在植物有效成分提取中已被廣泛應(yīng)用，相對于常規(guī)浸提工藝，提取效率顯著提高[20]。目前，柚皮活性成分的抑菌試驗(yàn)多建立在培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，而考察其在復(fù)雜的食品體系中抑菌效果的研究甚少。同時(shí)，S.aureus是引起食物中毒最為常見的致病菌[21]。因此，考察抑菌劑在食品中對S.aureus的抑制效果具有現(xiàn)實(shí)意義。研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化提取得到的江永香柚皮水提物作為天然抑菌劑在奶茶、酸梅湯、食用油、橙汁中應(yīng)用前景良好。

本研究發(fā)現(xiàn)，江永香柚皮水提物對6類不同食品中S.aureus均有一定的抑制作用，比較適合在酸梅湯、橙汁和奶茶等固形物含量少的食品中應(yīng)用。研究表明其對食用油中的S.aureus的抑制作用同樣較為突出，這是由于試驗(yàn)中對樣品的振蕩使得該體系形成了乳濁液，而在實(shí)際應(yīng)用中還需進(jìn)一步研究。迄今為止，江永香柚皮水提物的抑菌成分尚不明確，不同提取態(tài)的抑菌效果比較也缺乏數(shù)據(jù)支持。