周曉光 王浩舟 李彥生

[摘要] 目的 建立更加快速便捷的腎臟腫瘤及正常腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。 方法 選取2019年1—3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院行腎癌根治性切除術(shù)和腎部分切除術(shù)后患者新鮮的腎透明細(xì)胞癌組織和腎臟皮質(zhì)組織。采用機(jī)械分解，膠原酶消化和細(xì)胞連續(xù)篩分提純的方法提純腫瘤和正常原代細(xì)胞。分別通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)鑒定兩種原代細(xì)胞的遺傳背景，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，透射電鏡觀察原代細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。最后采用裸鼠荷瘤模型鑒定腫瘤細(xì)胞的成瘤特性。 結(jié)果 共計(jì)分離純化3株人近端腎小管上皮原代細(xì)胞，8株腎透明細(xì)胞癌原代細(xì)胞。RNA-seq顯示測(cè)序結(jié)果符合兩類細(xì)胞的遺傳學(xué)背景，免疫細(xì)胞化學(xué)可鑒定出近端腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)。透射電鏡可觀察到兩類細(xì)胞特異性超微結(jié)構(gòu)。裸鼠荷瘤模型證實(shí)了腎癌原代細(xì)胞的成瘤特性。 結(jié)論 成功建立并確定一種快速便捷的腎癌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的流程和方法。

[關(guān)鍵詞] 原代細(xì)胞培養(yǎng);腎細(xì)胞癌;近端腎小管上皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

[中圖分類號(hào)] R737.11 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（b）-0004-05

[Abstract] Objective To establish a more rapid and convenient method for primary culture of renal tumor and normal renal tubular epithelial cells. Methods Fresh clear renal cell carcinoma tissue and renal cortical tissue from patients undergoing radical nephrectomy and partial nephrectomy in Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University from January to March 2019 were selected. The tumor and normal primary cells were purified by mechanical segmentation， collagenase digestion and continuous cell screening and purification. The genetic background of the two primary cells was identified by transcriptomic sequencing （RNA-seq） technique， the expression of cell markers was identified by immunocytochemistry， and the ultrastructure of the primary cells was observed by transmission electron microscopy. Finally， the tumorigenesis characteristics of tumor cells were identified by the model of nude mice bearing tumors. Results A total of three human proximal tubular epithelial primary cells and eight renal clear cell carcinoma primary cells were isolated and purified. RNA-seq showed that the sequencing results were consistent with the genetic background of the two types of cells， and immunocytochemistry could identify the expression of marker proteins in the proximal renal tubular epithelial cells. Two kinds of cell specific ultrastructure could be observed by transmission electron microscope. The tumor bearing model of nude mice confirmed the tumorigenic properties of primary renal cell carcinoma cells. Conclusion A rapid and convenient processes and methods for primary culture of renal carcinoma cells and renal tubular epithelial cells is successfully established.

[Key words] Primary cells culture; Renal cell carcinoma; Human proximal tubular epithelial cells; Transcriptomic sequencing

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系統(tǒng)第二大腫瘤。進(jìn)展期腎癌的治療主要集中在靶向治療和免疫治療兩個(gè)方面，治療方法有限[1]。尋求更加有效的腎癌治療方法是臨床和科研工作者面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。精準(zhǔn)治療在RCC的治療過(guò)程中越來(lái)越受到重視。由于RCC腫瘤異質(zhì)性的存在[2]，商業(yè)化的腎癌細(xì)胞系雖可用作開(kāi)發(fā)新的治療方法的疾病模型，但在基因組和轉(zhuǎn)錄水平上并不能準(zhǔn)確地反映原發(fā)腎癌的遺傳特性。RCC的主要細(xì)胞亞型為腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）。全基因組分析顯示ccRCC細(xì)胞系的基因拷貝數(shù)改變和ccRCC組織存在較大差異[3]。又有研究發(fā)現(xiàn)兩者的基因轉(zhuǎn)錄普差異更為顯著[4]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道了原代細(xì)胞培養(yǎng)在腫瘤研究中的重要性[5-7]。更為重要的是，由于缺乏與腫瘤細(xì)胞相匹配的正常對(duì)照細(xì)胞，進(jìn)一步限制了抗腫瘤藥物篩選、藥理毒性研究等科研工作的開(kāi)展。本研究描述了一種快速便捷的人腎癌細(xì)胞（human renal tumour cells，HRTC）和人近端腎小管上皮細(xì)胞（human proximal tubular epithelial cells，HPTEC）原代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化流程和方法，并用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）的方法對(duì)培養(yǎng)物的遺傳學(xué)背景加以確認(rèn)。為RCC個(gè)性化藥物治療方法的發(fā)展提供了重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

原代HRTC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM（Gibco，12440053）培養(yǎng)基中。原代HPTEC培養(yǎng)于腎臟上皮細(xì)胞生長(zhǎng)專用培養(yǎng)基（PromoCell，c-26030）中。細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素溶液，0.05%胰蛋白酶EDTA溶液，不含CaCl2和MgCl2的HBSS緩沖液均購(gòu)自于Gibco，Ⅱ型膠原酶購(gòu)自于worthington（LS004176-1GM）。堿性磷酸酶試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所（D001-1-1）。Pan-Cytokeratin（CK）抗體（ZM-0069）、α-SMA抗體（ZM-0003）、Vimentin抗體（ZM-0260）、PAX8抗體（ZM-0468）和S-P偶聯(lián)免疫組織化學(xué)試劑盒（SP-9000）購(gòu)自于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。100、70、40 μm細(xì)胞篩購(gòu)自于BD FalconTM。

1.2 HRTC和HPTEC的分離、培養(yǎng)、凍存

1.2.1 HRTC和HPTEC的分離 ?選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）行腎癌根治性切除術(shù)和腎部分切除術(shù)后的手術(shù)標(biāo)本，共8例，男5例，女3例。患者平均年齡（58±6）歲，每份組織切取量約10 g。切取腎透明細(xì)胞癌組織和遠(yuǎn)離腫瘤的正常腎臟皮質(zhì)組織。切取組織均通過(guò)病理學(xué)評(píng)估。將組織浸入無(wú)菌IMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中并置于冰上，30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始細(xì)胞提取工作：①粉碎組織，組織盛放無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，頭戴式放大鏡下顯微操作。切除腫瘤組織內(nèi)血管筋膜等結(jié)締組織，保留黃色腫瘤組織。腎皮質(zhì)組織剔除腎周纖維囊。無(wú)菌眼科剪刀將組織切割為直徑約1 mm組織塊。②充分清洗，收集粉碎組織于15 mL離心管中，預(yù)冷無(wú)菌HBSS沖洗3遍。1000 r/min（離心半徑167 mm）離心10 min。③膠原酶消化，溶解100 mg Ⅱ型膠原酶（280 U/mg）于50 mL IMEM培養(yǎng)基中，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后備用。分別將10 mg腫瘤組織和正常腎組織置入25 mL膠原酶溶液中，置于37℃恒溫?fù)u床中，連續(xù)震蕩1～2 h。配合吸管間斷吹打增加組織裂解效果。④原代細(xì)胞連續(xù)篩分，膠原酶消化后的組織液離心后棄上清。預(yù)冷無(wú)菌HBSS反復(fù)沖洗3遍。再次預(yù)冷無(wú)菌HBSS重新懸浮細(xì)胞后，依次用100、70、40 μm細(xì)胞篩過(guò)濾。

1.2.2 HRTC和HPTEC的培養(yǎng)、凍存 ?過(guò)濾后的細(xì)胞懸液離心棄上清液后生理鹽水懸浮細(xì)胞。取20 μL細(xì)胞懸液加20 μL胎盤(pán)藍(lán)混勻后記數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞接種濃度為5×104/cm2。細(xì)胞充分吹打混勻后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置孵育箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。24 h后全量更換培養(yǎng)液，以后每3 d換液1次。細(xì)胞融合度80%左右時(shí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)或凍存。按照上述方法，HRTC細(xì)胞在接種后7～10 d達(dá)到傳代和凍存條件。HPTEC細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，則需要3～5 d。將第2～3代原代細(xì)胞進(jìn)行凍存，以控制傳代間的變異性。

1.3 原代細(xì)胞RNA-seq

Trizol法提取HPTEC和HRTC RNA。原代細(xì)胞的illumina RNA-seq工作交于北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成，具體方法同文獻(xiàn)[8]。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

HPTEC或HRTC接種于24孔板。細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3遍，4%甲醛固定20 min，1%Triton X-100溶液破膜5 min。之后細(xì)胞用1%牛血清白蛋白、0.4%Triton X-100和4%疊氮鈉混合物4℃封閉過(guò)夜。之后依次加入小鼠抗人一抗[pan-CK抗體（1∶100）α-SMA抗體（1∶100）、Vimentin抗體（1∶100）、PAX8抗體（1∶100）]及山羊抗鼠二抗（1∶100）室溫下分別孵育2 h。PBS沖洗3遍后，按照S-P偶聯(lián)免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PBS作為一抗陰性對(duì)照。中性樹(shù)脂封片后顯微鏡下觀察。

1.5 透射電鏡細(xì)胞超微檢測(cè)

收集原代HPTEC和HRTC。3%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制備超薄切片，在JEM-2100HR型透射電子顯微鏡（首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供）下觀察和鑒定HPTEC和HRTC超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.6 堿性磷酸酶染色

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)置入無(wú)菌細(xì)胞爬片，然后接種HPTEC。細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。堿性磷酸酶染色采用南京建成生物工程研究所堿性磷酸酶染色試劑盒。

1.7 裸鼠荷瘤模型建立

BALB/c（nu/nu）雌性裸鼠（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供）飼養(yǎng)于我院醫(yī)學(xué)研究中心暨國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科呼吸病學(xué)實(shí)驗(yàn)SPF屏障系統(tǒng)動(dòng)物室。鼠齡5～6周，體重18～20 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0005。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。選取2～3代原代HRTC，細(xì)胞懸浮于100 μL預(yù)冷的PBS和基質(zhì)膠（Matrigel）混懸溶液（PBS：Matrigel=1∶1）中。每次接種細(xì)胞量1.0×106個(gè)。接種于裸鼠左肋部建造腎癌裸鼠移植瘤模型。記錄成瘤時(shí)間，計(jì)算成瘤百分率，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑、短徑、重量，并進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 觀察原代細(xì)胞生長(zhǎng)觀察

共計(jì)分離純化得到3株原代HPTEC及8株原代透明細(xì)胞型HRTC。所有組織樣本均完成病理確認(rèn)。倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)。HPTEC形態(tài)呈典型的多邊鵝卵石樣，鏡下透明度及折光性強(qiáng)，各細(xì)胞緊密相靠，互相銜接，可見(jiàn)融合成片及復(fù)層生長(zhǎng)。HPTEC生長(zhǎng)速度較快，3～4 d細(xì)胞融合度可達(dá)80%～90%。HRTC呈多樣性，細(xì)胞形態(tài)大小不一。胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量的脂肪顆粒（圖1）。生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，傳代凍存間隔時(shí)間為5～6 d。在本實(shí)驗(yàn)的條件下，HRTC傳代5次以后生長(zhǎng)速度明顯變緩。HPTEC傳代10次左右時(shí)生長(zhǎng)速度未見(jiàn)明顯變緩。連續(xù)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過(guò)程中HRTC逐漸失去“透明細(xì)胞”表型，胞漿內(nèi)富含的脂肪顆粒隨傳代次數(shù)逐漸減少。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

3株HPTEC的基因表達(dá)譜如下圖所示（圖2A，封三）。測(cè)序結(jié)果提示HPTEC和HRTC均表達(dá)近端腎小管上皮的標(biāo)志物，均未見(jiàn)明顯遠(yuǎn)端腎小管上皮相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)（圖2B，封三）。分析HRTC與HPTEC的基因表達(dá)譜，兩種細(xì)胞差異基因的表達(dá)與文獻(xiàn)報(bào)道的腎癌和正常腎組織的差異基因的表達(dá)相符合（圖2C，封三）[9-11]。如在HRTC內(nèi)高表達(dá)的基因有：CA9、VEGFA、APLN、ALDH1A1、C4A、C4B、ENPP3、NDUFA4L2等。在HRTC內(nèi)低表達(dá)的基因有：VHL、PBRM1、MAL、SLIT2、GATA3、TFAP2B、TFCP2L1等（圖2C，封三）。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)與堿性磷酸酶檢測(cè)

所培養(yǎng)的HPTEC表達(dá)Pan-CK和PAX8蛋白，而沒(méi)有α-SMA和Vimentin的蛋白表達(dá)（圖3，封三）。堿性磷酸酶染色（偶氮偶聯(lián)法）中可見(jiàn)HPTEC和HRTC胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量棕紅色顆粒形成。提示原代細(xì)胞堿性磷酸酶含量豐富（圖4A～B，封三）。

2.4 透射電鏡細(xì)胞超微檢測(cè)

收集第2代HPTEC和HRTC送檢透射電鏡。透射電子顯微鏡下原代HPTEC可見(jiàn)典型的頂端微絨毛形成，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量線粒體形成（圖4C～D，封三）[12-13]。HRTC電鏡下胞質(zhì)內(nèi)充斥大量的脂滴，呈圓形卵圓形，沒(méi)有界膜，均電子密度。有少量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體及其他細(xì)胞器（圖4E，封三）[14-15]。

2.5 HRTC裸鼠移植瘤模型建立

使用分離純化得到的4株原代HRTC進(jìn)行裸鼠荷瘤模型建立。共接種裸鼠20只，荷瘤成功19只。皮下移植瘤模型的成瘤時(shí)間為5～7 d。皮下接種28 d后移植瘤平均長(zhǎng)徑為（23.58±2.85）mm，平均短徑為（11.18±1.89）mm，平均體積為（1988.13±359.76）mm3，平均瘤重為（1.45±0.27）g（圖4A）。移植瘤HE染色顯示，瘤體由大量透明細(xì)胞組成，癌細(xì)胞體積大，呈圓形或多邊形，輪廓清楚，具有清晰的胞膜，豐富透明的胞漿。組織間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量微血管結(jié)構(gòu)。經(jīng)兩名病理醫(yī)生確認(rèn)符合腎透明細(xì)胞癌的組織特征（圖4B）。

3 討論

由于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要，腫瘤患者的個(gè)體化治療被越來(lái)越多的患者所接受[16]。商業(yè)化的腎癌細(xì)胞系雖可用作臨床前期研究的工具細(xì)胞，但由于遺傳背景與原發(fā)腎癌的明顯差異，使研究結(jié)果缺乏直接的臨床指導(dǎo)意義。因此把人源性原代細(xì)胞作為工具細(xì)胞深入研究，更加具有臨床指導(dǎo)意義[1，17-18]。建立一種實(shí)用的方法從臨床組織標(biāo)本中分離原代腫瘤細(xì)胞和與之相匹配的原代正常細(xì)胞是很有必要的。

目前，永生化細(xì)胞系通常由病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生。雖然永生化細(xì)胞系易于體外培養(yǎng)，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)和多次傳代，永生化HPTEC細(xì)胞株將逐漸失去上皮表型和特性。又由于腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)的不穩(wěn)定性，RCC細(xì)胞系遺傳學(xué)背景與臨床RCC組織存在較大差異。相比之下，原代細(xì)胞更能代表人體真實(shí)生理環(huán)境和遺傳學(xué)背景。目前人原代HPTEC和HRTC培養(yǎng)物建立的難點(diǎn)是如何建立純度高、數(shù)量足、重復(fù)性好的原代HPTEC和HRTC培養(yǎng)物。常用的原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可分為兩類：組織塊貼壁法和膠原酶消化法。組織塊貼壁法培養(yǎng)原代HPTEC過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題是成纖維細(xì)胞和遠(yuǎn)端腎單位的污染[19-20]。另有研究試圖通過(guò)使用免疫磁珠技術(shù)或Percoll溶液密度梯度離心來(lái)促進(jìn)HPTEC的富集，但細(xì)胞提純流程繁瑣并且細(xì)胞產(chǎn)量低和活力低[21-22]。本研究證實(shí)機(jī)械分解，膠原酶消化和細(xì)胞連續(xù)篩分的原代細(xì)胞分離方法操作簡(jiǎn)單快捷。不僅增加了原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的獲得量，同時(shí)也避免了繁瑣的分離純化過(guò)程對(duì)細(xì)胞造成損傷，更大限度地保護(hù)了原代細(xì)胞的活性。本實(shí)驗(yàn)的另一關(guān)鍵在于如何精確獲取細(xì)胞組織。顯微操作應(yīng)用于分離目標(biāo)組織，可以更大限度地去除雜質(zhì)組織，有利于后期細(xì)胞純化。本實(shí)驗(yàn)的不足在于采用機(jī)械分離純化的方法，無(wú)法達(dá)到流式細(xì)胞分選的精度。但后期的RNA-seq結(jié)果卻證實(shí)了該方法所得細(xì)胞的純度較高?？赡苁且?yàn)榉蛛x純化后數(shù)目較多的目標(biāo)細(xì)胞成為“優(yōu)勢(shì)細(xì)胞”，在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中雜質(zhì)細(xì)胞失去了“細(xì)胞群體效應(yīng)”而最終消亡。

Valente等[23]建立一種與本研究相類似的分離提純?cè)?xì)胞的方法。然而，另一個(gè)研究采用同樣的方法提純HPTEC和HRTC[24]，卻得出令人困惑的結(jié)果。結(jié)果提示在基因測(cè)序過(guò)程中發(fā)現(xiàn)此法提純的原代腫瘤細(xì)胞中存在大量的正常細(xì)胞。為解決這一矛盾問(wèn)題，本研究試圖通過(guò)嚴(yán)格優(yōu)化原代細(xì)胞提純步驟，首次通過(guò)RNA-seq的方法驗(yàn)證原代細(xì)胞遺傳學(xué)背景。證實(shí)了機(jī)械分解，膠原酶消化和細(xì)胞連續(xù)篩分是一種快速便捷的原代細(xì)胞提純方法。所分離HPTEC和HRTC細(xì)胞純度高，符合文獻(xiàn)所報(bào)道的兩種細(xì)胞的遺傳學(xué)背景[9-11]。進(jìn)一步連續(xù)倒置顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)，隨傳代次數(shù)增多，HRTC逐漸失去“透明細(xì)胞”表型，胞漿內(nèi)富含的脂肪顆粒逐漸減少。具體細(xì)胞表型變化的分子機(jī)制還待后續(xù)進(jìn)一步深入研究?？赡芘c體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)差異有關(guān)。因此，本研究使用第2～3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，以控制傳代間的變異性。

為確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述分離純化方法做了如下3點(diǎn)優(yōu)化：①嚴(yán)格剔除腫瘤組織內(nèi)壞死和血管等纖維結(jié)締組織，頭戴放大鏡下顯微操作;②膠原酶充分消化裂解組織，配合吸管間斷吹打增加組織裂解效果;③實(shí)驗(yàn)需選取1～3代的HRTC作為工具細(xì)胞。綜上，本研究驗(yàn)證了一種快速有效的原代HPTEC和HRTC分離提純方法，使為腎細(xì)胞癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供良好的細(xì)胞模型成為可能。

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（收稿日期：2020-06-01）