吳 偉，傅 宇，任俊麗，繆詩超，郭遠明，楊承虎*

1. 浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江 舟山 3160212. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 3160213. 浙江中藍環(huán)境科技有限公司，浙江 溫州 325000

引 言

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類典型的持久性有機污染物(persistent organic pollutants,POPs)，因其具有“三致”效應而倍受關注[1]。含取代基PAHs(substituted PAHs,S-PAHs)是水環(huán)境中PAHs重要組成部分，且S-PAHs較母環(huán)PAHs種類更多、組成更為復雜[2]。此外，由于取代基的存在S-PAHs性質(zhì)不同于其母環(huán)PAHs，并展現(xiàn)出各異的環(huán)境行為及毒性效應[3-4]，通常S-PAHs毒性效應(如致突變性和致癌性)強于其母環(huán)PAH[5]。近來，水環(huán)境中S-PAHs環(huán)境行為及生態(tài)效應已越來越為科研工作者所關注，因此與之密切相關的水溶態(tài)部分濃度的測定至關重要。

目前，水環(huán)境中S-PAHs分析方法主要以氣相色譜-質(zhì)譜[6]、液相色譜-質(zhì)譜[7]為主，但該法前處理過程繁瑣、耗時、所需萃取劑易對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，且萃取過程破壞了目標化合物在水環(huán)境中的原始賦存狀態(tài)。熒光法因其快速、靈敏及非破壞性而被廣泛用于水體中母環(huán)PAHs的測定[8]。結(jié)合S-PAHs分子中共軛π鍵結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生熒光的特性，基于熒光檢測S-PAHs的分析方法已開始被重視[9]。建立適合分析水環(huán)境中S-PAHs的熒光法的前提需了解水溶態(tài)S-PAHs熒光光譜特性。然而，有關不同取代基對PAHs熒光光譜特性的影響研究鮮見報道。此外，水環(huán)境因素(pH、溫度等)可對熒光峰位置和熒光強度造成干擾，因此有必要考察水溶液條件對S-PAHs熒光光譜特性的影響。

芘及含取代基的芘衍生物在水環(huán)境中常被檢出[4,7,10]，因此本研究以芘為母環(huán)PAHs代表，以1-氨基芘、1-硝基芘、1-甲基芘、1-羥基芘、1-溴芘及1-芘甲酸為S-PAHs代表。利用三維熒光光譜法研究不同pH條件下水溶態(tài)PAHs的熒光特性，分析了各PAHs熒光性質(zhì)與其分子結(jié)構(gòu)及pH的關系，以期為水環(huán)境中S-PAHs測定和解析提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 試劑

芘、1-羥基芘、1-氨基芘、1-甲基芘、1-芘甲酸、1-溴芘及1-硝基芘均購置Sigma-Aldrich公司，純度均大于96%，使用前未提純，由ECOSAR v1.11計算得到7種PAHs的溶解度分別為0.135，4.045，2.411，0.058 38，0.149，0.013 38及0.011 8 mg·L-1。由ACDLAB軟件計算得到1-羥基芘、1-氨基芘及1-芘甲酸的pKa值分別9.4，3.937及3.676。乙醇、NaOH及HCl購置國藥，均為分析純試劑。

1.2 方法

稱取適量固體PAHs，分別配制成50.0 mg·L-1的乙醇儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存、待用。分別取4 μL PAHs儲備液至含20 mL背景溶液(0.01 mol·L-1NaCl,pH=3～11)的棕色玻璃瓶中，搖勻，靜置20 min后進行檢測(乙醇加入量為0.02%，助溶劑效應可忽略)。

利用Cary Eclipse熒光分光光度計(Agilent，美國)測定PAHs三維熒光光譜。激發(fā)波長(λex)范圍為220～450 nm，發(fā)射波長(λem)范圍為350～500 nm； 激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度分別為5和10 nm； 激發(fā)、發(fā)射步距均為1 nm； 掃描速度為2 400 nm·min-1； 1-溴芘及1-硝基芘測量PMT電壓為800 V，其余PAHs為600 V。以Milli-Q水為空白。樣品熒光光譜減去Milli-Q水的熒光光譜以消除拉曼散射的影響，熒光強度用Raman單位(R.U.)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光峰分布規(guī)律

2.1.1 取代基對熒光峰分布影響規(guī)律

圖1(a)—(f)分別展示了芘、1-羥基芘、1-氨基芘、1-甲基芘、1-芘甲酸和1-溴芘在不同pH條件下三維熒光光譜(1-硝基芘無明顯熒光峰，故未給出熒光譜圖)。可知，相同pH條件下芘及5種含取代基芘衍生物的熒光峰位置存在相似性，整體呈現(xiàn)出熒光峰的熒光激發(fā)波長位置相近，這主要由于6種PAHs均具有芘環(huán)所致。同時，6種PAHs熒光光譜又有顯著不同之處，表明芘環(huán)上取代基的結(jié)構(gòu)對其熒光峰位置有不同影響。如在pH=7時，芘、1-羥基芘、1-氨基芘、1-甲基芘、1-芘甲酸和1-溴芘最大熒光峰位置依次分別為λex/λem=238/374 nm，λex/λem=240/386 nm，λex/λem=241/442 nm，λex/λem=240/376 nm，λex/λem=241/381 nm和λex/λem=240/379 nm，表明—OH，—NH2，—CH3，—COOH及—Br均可導致芘環(huán)激發(fā)和發(fā)射波長產(chǎn)生不同程度紅移，其中激發(fā)波長紅移2～3 nm，發(fā)射波長紅移2～68 nm。王碧等[11]研究結(jié)果顯示苯酚、苯胺、甲苯、氯苯同樣均較苯的熒光光譜發(fā)生紅移。這主要是助色團(—OH，—NH2，—CH3，—Br)和生色團(—COOH)增加了芘環(huán)的生色能力，使其吸收波長向長波方向移動，進而導致熒光光譜紅移。此外，1-氨基芘僅有一個發(fā)射峰，與其他5種PAHs熒光峰存在顯著差異。

2.1.2 pH對熒光峰分布影響規(guī)律

溶液pH可影響具有弱酸或弱堿性的熒光物質(zhì)的電荷狀態(tài)，進而改變熒光物質(zhì)的基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的能級間隔，從而導致熒光光譜性質(zhì)發(fā)生變化。由圖1可知，不同pH下芘、1-甲基芘及1-溴芘的熒光峰位置無顯著變化，表明pH對這3種PAHs的熒光峰位置無干擾。1-羥基芘熒光光譜峰位置在pH≤9與pH=11時明顯不同，其在pH≤9與pH=11時最大熒光峰位置分別為λex/λem=240/386 nm和λex/λem=242/450 nm，即熒光光譜在pH=11較pH≤9時發(fā)生明顯紅移，且發(fā)射峰位置由二個變?yōu)橐粋€[圖1(b)]。這主要是由于1-羥基芘負離子與其分子態(tài)相比，增加了未成鍵電子，更有利環(huán)上π電子共軛，因而在pH=11時光譜發(fā)生紅移。1-氨基芘在pH=3時，其最大激發(fā)波長比其在pH≥5時短3 nm，表明—NH2的質(zhì)子化作用，導致光譜發(fā)生藍移。1-芘甲酸熒光光譜峰位置在pH=3和pH≥5時存在顯著差異，其在pH=3和pH≥5時最大熒光峰位置分別為λex/λem=241/413 nm和λex/λem=241/381 nm，即熒光光譜在pH≥5較pH=3時發(fā)生明顯藍移，且發(fā)射峰位置由一個變?yōu)槎€[圖1(e)]，這主要是由于羧基的質(zhì)子離解作用，引起光譜向短波方向移動。

2.2 熒光峰強度變化規(guī)律

2.2.1 取代基對熒光峰強度影響規(guī)律

圖1 (a)芘、(b) 1-羥基芘、(c) 1-氨基芘、(d) 1-甲基芘、 (e) 1-芘甲酸和(f) 1-溴芘在不同pH條件下三維熒光光譜Fig.1 Three-dimensional fluorescence spectra of (a) Pyrene, (b) 1-Hydroxypyrene, (c) 1-Aminopyrene, (d) 1-Methylpyrene,(e) 1-Pyrenecarboxylic acid and (f) 1-Bromopyrene under different pH conditions

Br和I)等重原子后，分子內(nèi)共軛效應(+E)小于誘導效應(-I)，導致共軛體系電子云密度下降。重原子可增強熒光分子中電子自旋軌道耦合作用，S1→T1的系間交叉躍遷速率增加，使得熒光強度減弱，磷光強度增強。

1-羥基芘、1-氨基芘和1-芘甲酸與水之間的氫鍵的幾何優(yōu)化、振動頻率和單點能均由密度泛函理論(density functional theory，DFT)計算獲得。其中，幾何優(yōu)化和振動分析在M06-2X/def2-SVP水平下進行，并通過SMD溶劑化模型考慮水的溶劑化作用； 單點能計算在M06-2X/def2-TZVP下完成[12-14]。DFT計算用Gaussian9.0軟件完成。1-羥基芘、1-氨基芘和1-芘甲酸與水之間的氫鍵鍵長分別為1.74，1.94和1.57 ?，鍵能分別為-8.8，-5.2和-5.4 kcal·mol-1。

圖2 PAHs在不同pH條件下相對熒光強度Fig.2 The relative fluorescence intensity ofPAHs under different pH conditions

圖3 (a)1-羥基芘、(b)1-氨基芘和(c)1-芘甲酸 與水結(jié)合的復合物結(jié)構(gòu)

2.2.2 pH對熒光峰強度影響規(guī)律

由圖2可知，相同濃度下芘及1-甲基芘的熒光強度在pH為3～11時波動較小，表明pH對兩者的熒光強度無顯著影響。1-羥基芘在pH為3～9時，熒光強度高且穩(wěn)定； 而在pH為11時，其熒光信號急劇下降，與pH對苯酚熒光強度的影響一致，這主要由于在該pH條件下1-羥基芘分子發(fā)生了離解反應形成了離子態(tài)，表明—OH的結(jié)構(gòu)形態(tài)是影響1-羥基芘和苯酚熒光特性的重要因素。1-氨基芘熒光信號在 pH為5～11時略低于pH=3時，而1-芘甲酸在pH為5～11時略高于其在pH為3時的熒光信號。此外，已有研究表明苯胺在pH<4時，幾乎無熒光； 在pH為6～8時，有較強熒光信號； 當pH>8時，其熒光強度逐漸減小[15]。綜上，pH對含不同取代基熒光物質(zhì)熒光特性的影響不僅與取代基有關，還與其母體結(jié)構(gòu)有關。

3 結(jié) 論

水溶態(tài)芘衍生物熒光光譜特性與其取代基結(jié)構(gòu)及溶液pH有關?！狾H，—CH3，—NH2，—COOH及—Br均使得芘環(huán)熒光峰位置發(fā)生不同程度的紅移； 給電子基團—OH，—CH3可增強芘環(huán)分子的熒光效率，但給電子基團—NH2對芘環(huán)熒光強度影響并不明顯； 吸電子基團—NO2及與重原子取代基—Br可降低芘環(huán)分子的熒光效率，但吸電子基團—COOH可小幅度增加芘環(huán)分子的熒光效率。pH在3～11范圍內(nèi)其對芘、1-甲基芘及1-溴芘的熒光峰位置及熒光強度無顯著影響； 在pH=11時，1-羥基芘分子發(fā)生離解反應形成了離子態(tài)，使得其熒光峰紅移，且熒光強度顯著下降。1-氨基芘和1-芘甲酸上的—NH2和—COOH在pH=3條件下發(fā)生質(zhì)子化作用，使得1-氨基芘和1-芘甲酸熒光峰分別較pH≥5時發(fā)生藍移和紅移； 1-氨基芘熒光強度在pH=3時略高于pH≥5，而1-芘甲酸熒光強度在pH=3時略低于pH≥5。未來工作中，我們還需關注取代基對不同母環(huán)PAHs熒光光譜特性影響規(guī)律，可為PAHs原位熒光檢測方法的建立提供重要基礎依據(jù)。