李 響，李中峰，高 俊，王 霞，張 欣，張卓勇

首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京 100048

引 言

種子萌發(fā)是糧食作物生長過程中極為重要的一個環(huán)節(jié)，通常分為三個階段，第一階段，種子吸脹，細胞質(zhì)水合化； 第二階段，種子吸水速度緩慢，萌發(fā)過程的初始階段處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，代謝變化較少； 第三階段，胚根突破種皮幼苗成長。此期間種子中的各種成分急劇變化[1]，例如磷脂質(zhì)、甘油三酯、烴類含量不斷下降，而單甘油酯、甾醇類以及游離脂肪酸含量升高[2]。研究種子代謝過程中成分的變化能夠揭示種子萌發(fā)生長中的關(guān)鍵代謝通路。通過核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等高通量技術(shù)期望同時鑒定數(shù)十甚至數(shù)百種的代謝物來推測生物體內(nèi)發(fā)生的代謝變化[3]，然而譜學(xué)技術(shù)獲得的代謝數(shù)據(jù)極其復(fù)雜，需要利用化學(xué)計量學(xué)方法提取其中有效的信息，了解生物功能，識別代謝機理和生物標志物[4]。主成分分析(PCA)，偏最小二乘(PLS)，正交偏最小二乘(OPLS)等以潛變量之間相互正交為核心約束的方法在NMR代謝組學(xué)中應(yīng)用極為廣泛，然而數(shù)學(xué)上的正交并非儀器測量中自然物質(zhì)存在的信號規(guī)律，經(jīng)這些方法分析所獲得的結(jié)果往往很難與光譜庫進行直接檢索。多元曲線分辨(MCR)方法能夠靈活地利用已知條件對數(shù)據(jù)實現(xiàn)約束，并獲得符合理化意義的波譜結(jié)果[5]。

本研究通過不同約束下的多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)解析1H-NMR譜，以實現(xiàn)非靶向代謝組學(xué)研究分析植物特定時期的差異性代謝，解釋綠豆的不同萌發(fā)時間階段代謝物變化規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 樣品處理

將綠豆用去離子水浸泡2 h后，用10%NaClO溶液消毒15 min，用去離子水清洗7次[6]。將清洗過的綠豆放入燒杯后，置于恒溫培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)，選取萌發(fā)時間分別為24，36和48 h的樣本各30例，實驗總樣本數(shù)為90例。將萌發(fā)后的綠豆樣品經(jīng)液氮處理后研磨，置于-80 ℃冷凍，凍干。凍干后的粉末樣品每份稱取100 mg，分別加入3 mL 50%甲醇超聲，提取代謝物，取上清液，氮吹后，凍干。測試前加入600 μL重水超聲溶解。采用VARIAN 600 MHz核磁共振氫譜儀(美國瓦力安公司)進行1H-NMR測試，譜寬設(shè)定為20 ppm(12 kHz)，掃描次數(shù)128,溫度為27 ℃,采樣數(shù)據(jù)點為16 k，以乳酸化學(xué)位移1.336 ppm的質(zhì)子信號為標準進行定標。

1.2 數(shù)據(jù)處理

將測得的核磁數(shù)據(jù)，利用MestReNova軟件進行相位校正、基線校正和化學(xué)位移漂移校正。相位校正首先通過一階相位校正方法對數(shù)據(jù)進行處理，見式(1)和式(2)

(1)

(2)

基線校正采用了多項式擬合方法，平均積分范圍內(nèi)的所有數(shù)據(jù)點對數(shù)據(jù)進行分段積分，積分范圍包含0.80～9.20 ppm，去除重水峰4.50～5.23 ppm，去除甲醇峰3.35～3.39 ppm，積分區(qū)間為0.01。最后，通過對總面積進行歸一化處理。

將積分后得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab中，得到90×841個變量的數(shù)據(jù)矩陣。

多元曲線分辨率(MCR)是基于雙線性模型的一種化學(xué)計量學(xué)方法，在數(shù)學(xué)上將混合物的響應(yīng)，分解為所研究系統(tǒng)中涉及的每個主成分的純信號貢獻[7-8]。

多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)以交替方法對數(shù)據(jù)進行迭代，得到數(shù)據(jù)的濃度分布和光譜矩陣，原理如式(3)

D=CST+E

(3)

式(3)中，D(m×n)為核磁共振數(shù)據(jù)矩陣，有m個樣本，n個波譜變量，C(m×p)和ST(p×n)為提取后主成分的濃度矩陣和NMR波譜矩陣，C對應(yīng)代表綠豆代謝物的濃度矩陣，ST為綠豆代謝物主成分的核磁共振氫譜圖。E為誤差矩陣。p是該體系的主成分個數(shù)。

在雙線性模型中，不充分的約束會導(dǎo)致最終模型受到旋轉(zhuǎn)模糊的影響，存在非唯一解。在此工作中，NMR提供的代謝物信號不可能出現(xiàn)負值，代謝物的信號貢獻也不可能為負值，所以可以同時對光譜和濃度矩陣施加非負約束。此外，在不同時段存在特定代謝物的生成和消失，可通過選擇性約束對不同時段中的代謝物的濃度矩陣進行約束。

2 結(jié)果與討論

首先，MCR模型需要確定主成分的個數(shù)，這將直接影響到MCR對結(jié)果的解析。依據(jù)PCA結(jié)果確定主成分個數(shù)為3，這時解釋原變量方差的百分比為99.46%，選擇更多的主成分可能會過度擬合噪聲。

由于在僅使用非負約束的模型中存在不唯一解，將濃度下降趨于零的部分作為約束對象，推測此主成分對應(yīng)的代謝物是在代謝過程中降解的成分，于是使用選擇性約束以實現(xiàn)在迭代過程中尋找更接近真實的解。

在以往的報道中，核磁定量分析可以通過T1回溯轉(zhuǎn)換法得以實現(xiàn)但方法較為繁瑣，需要內(nèi)標和待觀察物的T1值、以及非全弛豫一維譜圖[6]。通過對NMR數(shù)據(jù)得到的矩陣運用MCR-ALS方法進行處理，從而獲得三種主成分以及各主成分所包含的代謝物。將每種主成分的響應(yīng)數(shù)據(jù)繪制出箱型圖，可以根據(jù)箱型圖直觀地看出每種主成分中各個代謝物的相對含量變化趨勢，此方法較為直觀和簡便。

圖1為經(jīng)過預(yù)處理后的核磁共振譜，每條譜線對應(yīng)一個待測樣本的氫譜。通過圖1可以看出在各豆種子萌發(fā)的NMR圖譜中存在一定差異，然而由于代謝成分較為復(fù)雜，各化合物的特征峰高度重疊，難以獲得有用的代謝規(guī)律信息。

圖1 綠豆萌發(fā)代謝物的原始1H-NMR圖譜

圖2為MCR僅在對濃度和光譜方向使用非負約束下的結(jié)果，圖中分別顯示了三個時間段樣本濃度變化的箱型圖及其對應(yīng)主成分的NMR純光譜。NMR純光譜從圖(a2)，(b2)和(c2)中可以看出三種主成分的光譜信息，具體特征峰對應(yīng)代謝物如表1。箱型圖由最小值(min)，下四分位數(shù)(Q1)，中位數(shù)(median)，上四分位數(shù)(Q3)，最大值(max)繪制而成。從濃度變化圖2(a1)中可以看出第一主成分在第一階段含量明顯降低。如圖2(b1)所示，第二主成分在整個萌發(fā)期間含量呈上升趨勢。如圖2(c1)所示，第三主成分在萌發(fā)初期含量升高，在萌發(fā)后期含量大幅下降。

圖2 僅使用非負約束條件下，MCR獲得的三種主成分對應(yīng)物質(zhì)的的含量變化及其1H-NMR圖(a)： 第一主成分； (b)： 第二主成分； (c)： 第三主成分

其中第二主成分24 h組濃度趨向為0，推測此主成分對應(yīng)的代謝物在實際代謝變化中濃度在下降，可以使用選擇性約束對這一位置進行約束。

如圖3所示，依照僅非負約束MCR結(jié)果的提示對第二主成分，在 24h組的樣本濃度方向施加選擇性約束。圖3(a1)，(b1)和(c1)三幅圖分別為在此約束條件下，第一主成分、第二主成分以及第三主成分在24，36和48 h含量而得出的誤差圖。圖3(a2)，(b2)和(c2)分別為第一主成分、第二主成分以及第三主成分的1H-NMR圖。如圖3(a1)所示，第一主成分在萌發(fā)初期含量下降，在萌發(fā)后期含量小幅度升高。如圖3(b1)所示，第二主成分在整個萌發(fā)期間含量保持上升趨勢。如圖3(c1)所示，第三主成分在萌發(fā)初期含量升高，在萌發(fā)后期含量大幅度下降。

圖3 MCR結(jié)合選擇性約束(第二個主成分， 24 h組)得到的各主成分的1H-NMR和濃度箱型圖(a)： 第一主成分； (b)： 第二主成分； (c)： 第三主成分Fig.3 The boxplot of concentrations (a1—c1) and the 1H-NMR spectra (a2—c2)obtained by MCR with selectivity constraint(a)： The first principal component； (b)： The second principal component； (c)： The third principal component

圖4 MCR結(jié)合選擇性約束(第二個主成分， 24 h組) 得到的各主成分的1H-NMR圖(a)： 第一主成分； (b)： 第二主成分； (c)： 第三主成分Fig.4 The 1H-NMR sqectra (a—c) obtainedby MCR with selectivity constraint(a)： The first principal component；(b)： The second principal component；(c)： The third principal component

根據(jù)文獻[6]對綠豆種子提取物中的代謝物特征峰進行識別，可從MCR結(jié)果的圖譜中找到如表1所示代謝物。

其中，第一主成分中包含的代謝物有： 乳酸、乙酸、2-氨基-4-氧戊酸、膽堿、棉籽糖家族寡糖、α-半乳頹、蔗糖、N1-甲基煙酸； 第二主成分中包含的代謝物有： 纈氨酸、乙酸、α-酮戊二酸、2-氨基-4-氧戊酸、膽堿、棉籽糖家族寡糖、蔗糖、色氨酸、苯丙氨酸、肌苷、N1-甲基煙酸； 第三主成分中包含的代謝物有： 乳酸、2-氨基-4-氧戊酸、蘋果酸、檸檬酸、O-甲基鯊肌酸、磷酸膽堿、棉籽糖家族寡糖、α-半乳糖、N1-甲基煙酸。

表1 綠豆提取物的譜峰歸屬Table 1 Peak assignment of mung bean extract

3 結(jié) 論

通過MCR-ALS結(jié)合1H-NMR譜，實現(xiàn)了對綠豆種子萌發(fā)的非靶向代謝組學(xué)研究，模型充分利用了測定體系的先驗信息進行約束，得到了具有理化意義的光譜信息和相對濃度變化代謝信息。結(jié)果表明乙酸、膽堿在綠豆萌發(fā)前期存在，萌發(fā)后期含量呈現(xiàn)升高趨勢； 蔗糖、纈氨酸、α-酮戊二酸色氨酸、苯丙氨酸、肌苷在萌發(fā)之前未見存在，隨綠豆萌發(fā)時間不斷延長，不斷合成，并且含量逐漸增加； O-甲基鯊肌酸、磷酸膽堿、α-葡萄糖在萌發(fā)前存在，在萌發(fā)初期不斷增加，直至萌發(fā)后期，因被消耗而含量逐漸降低，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。乳酸、2-氨基-4-氧戊酸、蘋果酸、檸檬酸、膽堿、棉籽糖家族寡糖、α-半乳糖、N1-甲基煙酸在綠豆萌發(fā)期間一直存在，含量未見明顯變化。