吳思俊，龍之祥，彭祖仁，仇 萍，李 正，李文龍*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617;2.省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617; 3.湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，湖南 懷化 418000)

結(jié)晶(Crystallization)是指從飽和溶液中凝結(jié)，或從氣體中凝華出具有一定幾何形狀的固體的過(guò)程，是分離與純化中最傳統(tǒng)的操作之一[1-2]。因其高效、低能耗、污染小的特點(diǎn)，結(jié)晶已在制藥、化工及石油領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。在醫(yī)藥生產(chǎn)領(lǐng)域，約有85%的產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中包含結(jié)晶操作[3]。結(jié)晶過(guò)程決定了固態(tài)產(chǎn)品的形貌、晶型及純度等多種特性，此外還會(huì)對(duì)結(jié)晶產(chǎn)品活性藥物成分的整體生產(chǎn)效率產(chǎn)生重要影響，主要表現(xiàn)在對(duì)下游操作的影響[4]。因此，對(duì)藥物結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行有效控制對(duì)于藥物生產(chǎn)過(guò)程總效率的提高和藥物成品質(zhì)量的改善具有重要意義。然而，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，大部分藥物分子往往不止一種晶體形式，同一藥物的晶體可能具有兩種或兩種以上的晶胞常數(shù)和空間結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象被稱為多晶型現(xiàn)象[5]。對(duì)某些藥物而言，晶型是影響其臨床療效的關(guān)鍵因素之一。同一藥物由于晶型不同，其溶解度、密度、硬度、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)可能存在顯著差異，進(jìn)而影響藥物的生物利用度，并最終對(duì)藥效產(chǎn)生影響，良藥可能變成無(wú)效藥甚至是毒藥[6]。

近些年，關(guān)于監(jiān)控晶型轉(zhuǎn)變過(guò)程的相關(guān)研究也并未中斷，但大多數(shù)企業(yè)主要采用傳統(tǒng)的調(diào)控策略。這種策略對(duì)流程和運(yùn)行軌跡要求固定的操作流程，并受到監(jiān)管部門的嚴(yán)格管控，所以結(jié)晶過(guò)程可調(diào)控的空間范圍很小。因此，產(chǎn)品質(zhì)量需通過(guò)最終檢測(cè)的方式來(lái)決定。這種通過(guò)對(duì)最終產(chǎn)品進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)來(lái)表征結(jié)晶過(guò)程輸入輸出關(guān)系的策略往往無(wú)法突破過(guò)程變化的“黑匣子”，因此開(kāi)發(fā)出一套對(duì)整個(gè)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)、反饋，并最終實(shí)現(xiàn)有效調(diào)控的研究方法顯得尤為重要[7]。

2004年，過(guò)程分析技術(shù)(Process analytical technology,PAT) 概念由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)提出，該技術(shù)強(qiáng)調(diào)對(duì)制藥工藝過(guò)程機(jī)制的理解，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、分析以及調(diào)控關(guān)鍵物料和工藝參數(shù)來(lái)確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和工藝過(guò)程的可靠性[8-9]。PAT中的分析是涵蓋多學(xué)科的綜合性分析，PAT的應(yīng)用貫穿整個(gè)制藥生產(chǎn)過(guò)程。在液體制劑生產(chǎn)過(guò)程(如醇沉、堿沉、柱層析、配液、萃取、反應(yīng)等)質(zhì)控領(lǐng)域，關(guān)于PAT技術(shù)的應(yīng)用已有研究報(bào)道[10-17]。而結(jié)晶工藝的監(jiān)控則較為特殊，它涉及液體與固體兩部分，前者是通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液濃度進(jìn)行調(diào)控，后者則是通過(guò)獲取晶體固相信息的方式實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。對(duì)于這種復(fù)雜的制藥工藝體系，傳統(tǒng)的分析技術(shù)和控制策略已不再適用。運(yùn)用PAT技術(shù)進(jìn)行結(jié)晶過(guò)程在線監(jiān)控，有助于結(jié)晶工藝的開(kāi)發(fā)、優(yōu)化、分析以及調(diào)控，減少過(guò)程的不確定性和風(fēng)險(xiǎn)，從而最終實(shí)現(xiàn)由質(zhì)量源于檢驗(yàn)(Quality by test,QbT)向質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(Quality by design,QbD)理念的轉(zhuǎn)變[18]。近年來(lái)，連續(xù)結(jié)晶技術(shù)在制藥生產(chǎn)領(lǐng)域得到了較大關(guān)注，與目前較為普遍的間歇結(jié)晶技術(shù)相比，連續(xù)結(jié)晶技術(shù)的生產(chǎn)效率及產(chǎn)品質(zhì)量更高，且操作和控制更便捷，但同時(shí)也對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。為了快速、精準(zhǔn)地檢測(cè)體系中溶解度等參數(shù)，需實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)晶過(guò)程的組分濃度和溫度，并結(jié)合粒度分布，從而有效調(diào)整結(jié)晶過(guò)程的操作參數(shù)，最終得到制藥工藝需要的結(jié)晶。連續(xù)結(jié)晶技術(shù)在飛速發(fā)展的同時(shí)也對(duì)PAT技術(shù)的發(fā)展起到了鞭策作用[19]。隨著PAT技術(shù)的發(fā)展，結(jié)晶過(guò)程成功應(yīng)用了眾多新穎且實(shí)用的技術(shù)，例如拉曼光譜(RS)[20]、衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)[21]、衰減全反射紫外/可見(jiàn)光譜(ATR-UV/Vis)[22]、近紅外(NIR)光譜[23]、粒子圖像測(cè)量(PVM)以及聚焦光束反射測(cè)量(FBRM)等原位監(jiān)測(cè)技術(shù)[24-25]，有效提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量與監(jiān)測(cè)靈活性，同時(shí)保證了過(guò)程的可靠性。本文將對(duì)上述幾種技術(shù)的原理及其相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)結(jié)晶過(guò)程在線監(jiān)控技術(shù)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 基于結(jié)晶過(guò)程溶液濃度信息的PAT

用于在線監(jiān)控結(jié)晶過(guò)程的PAT技術(shù)可分為兩大類。第一類即通過(guò)測(cè)定溶液濃度進(jìn)而對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控的技術(shù)，常見(jiàn)的有衰減全反射模式光譜儀和電導(dǎo)率儀。然而，由于電導(dǎo)率儀易受細(xì)小顆粒和晶垢的影響，不適用于有機(jī)溶液體系，所以在結(jié)晶研究中應(yīng)用較少。在結(jié)晶過(guò)程中，目前應(yīng)用最為廣泛的衰減全反射模式光譜技術(shù)為ATR-FTIR和ATR-UV/Vis[26]。

第二類用于結(jié)晶過(guò)程的PAT技術(shù)是能直接提供固相信息(例如晶型、顆粒尺寸以及形貌分布等)的技術(shù)。晶體的形貌不僅包括形狀信息還包括晶型信息，因此獲取晶體形貌的相關(guān)特征對(duì)于結(jié)晶過(guò)程控制尤為重要。目前市面上的顆粒尺寸和晶型檢測(cè)的PAT技術(shù)有RS[27]、NIR光譜[28]、FBRM[29]和X射線衍射(XRD)[30]等技術(shù)。但對(duì)于晶體形貌的監(jiān)測(cè)，原位成像技術(shù)往往是最便捷且高效的手段，主要有PVM[31]和熱臺(tái)偏光顯微鏡(HSPM)[32]等。

1.1 過(guò)飽和度與衰減全反射傅里葉變換紅外光譜技術(shù)

過(guò)飽和度是晶體生長(zhǎng)和成核的基本推動(dòng)力，同時(shí)也是控制成品質(zhì)量的重要工藝參數(shù)，并將最終決定晶型尺寸分布[33]。當(dāng)過(guò)飽和度低時(shí)，晶體生長(zhǎng)快于成核，從而導(dǎo)致更大的晶體尺寸分布。當(dāng)過(guò)飽和度高時(shí)，晶體成核優(yōu)先于晶體生長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致晶體尺寸變小。因此如何實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)晶過(guò)程中過(guò)飽和度變化的監(jiān)測(cè)與表征，并最終使其處于一個(gè)動(dòng)態(tài)、可控制的范圍內(nèi)已成為制藥行業(yè)中的熱點(diǎn)問(wèn)題[34]。近年來(lái)，隨著PAT技術(shù)在各領(lǐng)域的迅速發(fā)展，結(jié)晶過(guò)程過(guò)飽和度表征技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。其中，ATR-FTIR技術(shù)已成為評(píng)估冷卻和反溶劑結(jié)晶過(guò)程中過(guò)飽和度的主要手段之一。

圖1 不同濃度L-谷氨酸溶液在相同溫度下的紅外光譜[42]Fig.1 IR spectra for different L-glutamic acid solution concentrations at the same temperature[42]

ATR-FTIR是通過(guò)檢測(cè)樣品吸收光學(xué)致密晶體反射出的紅外衰減波所產(chǎn)生的信號(hào)，然后將該信號(hào)轉(zhuǎn)化為紅外光譜，最終實(shí)現(xiàn)樣品表層化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息的表征[35]。利用衰減波的目的是減弱紅外吸收信號(hào)的強(qiáng)度，使溶液中化學(xué)成分信息獲得更好的表征，這也是ATR-FTIR技術(shù)與中紅外光譜技術(shù)的顯著區(qū)別之一。ATR-FTIR技術(shù)主要有以下優(yōu)勢(shì)：①與普通紅外光譜相比，ATR-FTIR制樣簡(jiǎn)單，幾乎無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行任何處理;②檢測(cè)速度快、靈敏度高，檢測(cè)點(diǎn)可達(dá)數(shù)微米;③可實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)、實(shí)時(shí)跟蹤;④環(huán)境友好，污染小。這些優(yōu)勢(shì)使得ATR-FTIR技術(shù)在結(jié)晶過(guò)程過(guò)飽和度的表征研究中頗受歡迎[36]。ATR-FTIR可根據(jù)不同組分的特征吸收峰對(duì)每種組分進(jìn)行定性和定量分析[37-38]。同時(shí)，作為一種實(shí)用且強(qiáng)大的在線分析技術(shù)，除了在結(jié)晶過(guò)程中的應(yīng)用外，其在藥物生產(chǎn)的其他多個(gè)環(huán)節(jié)，如混合度監(jiān)測(cè)、活性成分含量測(cè)定和包衣過(guò)程監(jiān)控等均有應(yīng)用[39]。Barrett等[40]利用ATR-FTIR吸收峰高度來(lái)描述溶質(zhì)的溶解度和溶解濃度，進(jìn)而描述過(guò)飽和度，為苯甲酸結(jié)晶放大工藝過(guò)程中過(guò)飽和度的控制提供了依據(jù)。這種峰高反饋控制方法可將溶解濃度控制在特定的設(shè)定值，進(jìn)而提供一個(gè)不僅可消除過(guò)量的細(xì)粉和結(jié)殼，而且可顯著提高晶體生長(zhǎng)和顆粒尺寸控制的環(huán)境。Zhang等[41]利用ATR-FTIR采集了L-谷氨酸冷卻結(jié)晶過(guò)程中的亞穩(wěn)態(tài)區(qū)(MSZ)與欠飽和區(qū)(USZ)的紅外光譜，運(yùn)用偏最小二乘算法分別建立MSZ光譜區(qū)、USZ光譜區(qū)和MSZ-USZ光譜區(qū)的溶液濃度校正模型，結(jié)果顯示用MSZ譜區(qū)進(jìn)行建模，在保證操作溫度變化穩(wěn)定的前提下，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)結(jié)晶過(guò)程中的溶液濃度。張方坤等[42]以L-谷氨酸結(jié)晶過(guò)程為例，探究了水和溫度對(duì)溶液ATR-FTIR測(cè)量的影響(如圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)用對(duì)應(yīng)溫度差譜法可有效消除水峰對(duì)溶質(zhì)光譜測(cè)量的干擾，進(jìn)而提升溶液濃度光譜標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)精度。

1.2 衰減全反射紫外/可見(jiàn)光譜

ATR-FTIR和ATR-UV/Vis兩類ATR光譜分析技術(shù)均適用于對(duì)溶質(zhì)濃度的檢測(cè)[43-44]。前者因紅外光譜的吸收光譜帶寬，使得大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)會(huì)對(duì)紅外光譜產(chǎn)生響應(yīng)，但運(yùn)用該方法需要建立濃度校正模型，且該模型會(huì)受到溶劑背景、測(cè)試條件等影響[45]。相比之下ATR-UV/Vis因其波長(zhǎng)與光程成反比，所以能夠分析得到更薄層的表面信息，且成本較低，成為結(jié)晶過(guò)程工藝研究的有效方法之一。雖然在某種程度上，ATR-UV/Vis技術(shù)不利于混合多組分的定量分析，但相對(duì)而言，由于譜圖簡(jiǎn)潔，因此若復(fù)雜體系中目標(biāo)物質(zhì)含有不受干擾的特定吸收峰，建模過(guò)程將非常簡(jiǎn)捷，模型預(yù)測(cè)效果也較為穩(wěn)健。

圖2 鄰氨基苯甲酸和對(duì)氨基苯甲酸的紫外光譜[47]Fig.2 UV spectra of OABA and PABA[47] OABA：o-aminobenzoic acid(鄰氨基苯甲酸); PABA：p-aminobenzoic acid(對(duì)氨基苯甲酸)

ATR-UV/Vis是由價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的一種電子光譜，該技術(shù)通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)對(duì)紫外/可見(jiàn)光的吸收程度，可得出該物質(zhì)的組成、含量以及結(jié)構(gòu)信息，其獲取信息便捷且精確。由于藥物的大多數(shù)活性成分具有紫外吸收，所以ATR-UV/Vis的適用范圍很廣泛，在藥物的結(jié)晶過(guò)程中可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)晶體成核、多晶型的轉(zhuǎn)變與過(guò)飽和度變化的原位監(jiān)測(cè)[46]。如圖2所示，Saleemi等[47]使用ATR-UV/Vis光譜技術(shù)對(duì)鄰氨基苯甲酸(OABA)、對(duì)氨基苯甲酸(PABA)的反溶劑/冷卻結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行研究，利用主成分分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)ATR-UV/Vis光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得了性能良好的校正模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩者濃度的同時(shí)監(jiān)測(cè)。李炳輝[48]采用ATR-UV/Vis光譜探究不同降溫速率、反溶劑添加速率對(duì)結(jié)晶過(guò)程的影響，測(cè)定了5’-肌苷酸二鈉和5’-核苷酸二鈉的反溶劑/冷卻結(jié)晶過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)合指數(shù)型經(jīng)驗(yàn)方程回歸得到了一系列不同初始溶劑、不同初始溫度時(shí)不同降溫速率、反溶劑添加速率的動(dòng)力學(xué)方程，具體控制策略是通過(guò)對(duì)比過(guò)飽和度與預(yù)設(shè)范圍值的上下限，確定過(guò)飽和度調(diào)整方向。當(dāng)過(guò)飽和度高于上限時(shí)，減小降溫速率和/或反溶劑添加速率;當(dāng)過(guò)飽和度低于下限時(shí)，則增大降溫速率和/或反溶劑添加速率;當(dāng)過(guò)飽和度在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)時(shí)，則不改動(dòng)工藝參數(shù)。此外，ATR-UV/Vis光譜還常被用于撲熱息痛、模型藥物AZD7009的結(jié)晶過(guò)程濃度監(jiān)測(cè)，并且構(gòu)建了過(guò)飽和度控制策略[49- 50]。

2 基于固相信息的PAT技術(shù)

2.1 拉曼光譜技術(shù)

在藥物生產(chǎn)過(guò)程中，最終藥物的純度非常重要，因?yàn)樗幬镏械碾s質(zhì)會(huì)降低藥物療效[51]，甚至產(chǎn)生副作用，例如產(chǎn)生原始藥物不具有的生理毒性[52]。藥物成品中的雜質(zhì)是指與藥物具有一定關(guān)系，能影響藥物純度并會(huì)導(dǎo)致藥效產(chǎn)生偏離的物質(zhì)。這些雜質(zhì)可能來(lái)自于操作時(shí)加入的表面活性劑、添加劑，或來(lái)自合成藥物時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)品、催化劑殘留物，也可能來(lái)自藥物生產(chǎn)時(shí)添加的溶劑等[53-54]。結(jié)晶過(guò)程中雜質(zhì)析出的原理主要有：①雜質(zhì)吸附在晶體表面;②雜質(zhì)嵌入晶格;③溶劑包裹。重結(jié)晶是提高結(jié)晶產(chǎn)品純度的傳統(tǒng)方法之一，但這種方法會(huì)降低產(chǎn)品的產(chǎn)量，且會(huì)使生產(chǎn)過(guò)程變得更加繁瑣。另一方面，藥物的多晶型現(xiàn)象普遍存在，藥物的不同晶型之間雖具有相同的化合物結(jié)構(gòu)，但由于晶格中藥物分子排布不一，不同晶型藥物的多項(xiàng)理化性質(zhì)和生物有效性往往存在顯著差別，進(jìn)而影響藥物的生物利用度、穩(wěn)定性以及療效。因此建立多晶型藥物的晶型監(jiān)測(cè)方法，對(duì)多晶型藥物結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)與調(diào)控，對(duì)于提升產(chǎn)品質(zhì)量和保證藥物安全性及有效性具有重要意義。近年來(lái)，隨著科研人員對(duì)RS技術(shù)認(rèn)識(shí)的深入，RS技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于多晶型藥物的結(jié)晶過(guò)程監(jiān)控以及結(jié)晶過(guò)程雜質(zhì)研究。在藥物結(jié)晶過(guò)程中，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)晶過(guò)程中晶體純度和晶型狀態(tài)的在線監(jiān)測(cè)，滿足藥物生產(chǎn)過(guò)程中越來(lái)越高的結(jié)晶質(zhì)量要求。

RS是一項(xiàng)成熟的在線監(jiān)測(cè)技術(shù)，屬于散射光譜，主要用于研究晶格和分子的振動(dòng)模式、轉(zhuǎn)動(dòng)模式以及在某一系統(tǒng)中的其他低頻模式。RS與紅外光譜在分子結(jié)構(gòu)分析上的互補(bǔ)性也是其獲得廣泛應(yīng)用的原因之一[55]。RS譜峰比較尖銳，在研究無(wú)機(jī)混合物時(shí)峰強(qiáng)度強(qiáng)于紅外光譜，一些紅外光譜無(wú)法測(cè)定的結(jié)構(gòu)信息往往在RS上能很好地呈現(xiàn)，相反，在鑒定有機(jī)化合物時(shí)紅外光譜優(yōu)勢(shì)則更加明顯。由于水具有很強(qiáng)的紅外吸收，而具有很弱的RS吸收，所以RS技術(shù)也常用于液體結(jié)晶過(guò)程的研究。在線拉曼技術(shù)可以監(jiān)測(cè)晶型轉(zhuǎn)變過(guò)程，能對(duì)晶型轉(zhuǎn)變的起點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行判別，并獲取晶型轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)信息，從而有助于更深層次地理解該晶型的轉(zhuǎn)變工藝，了解在實(shí)驗(yàn)條件下需要熟化的時(shí)間，以避免因摻雜過(guò)量雜質(zhì)晶而影響藥物的整體療效。在線拉曼技術(shù)還可對(duì)結(jié)晶過(guò)程中晶體和溶液進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測(cè)，用以定性和定量跟蹤溶液濃度和固相晶型產(chǎn)品濃度的變化趨勢(shì)，得到析晶趨勢(shì)圖，從而可以直觀判斷析晶點(diǎn)、析晶速率和析晶平衡等數(shù)據(jù)，還可建立定量標(biāo)準(zhǔn)模型，得到體系的實(shí)時(shí)過(guò)飽和度數(shù)據(jù)，直接從源頭控制結(jié)晶過(guò)程，尤其適用于多晶型的工藝開(kāi)發(fā)，達(dá)到優(yōu)化工藝參數(shù)的目的[56]。楊偉峰等[57]以硫酸氫氯吡格雷片為研究對(duì)象，利用激光顯微共焦拉曼光譜儀建立不同廠家藥片晶型的定性判別模型，聚類分析結(jié)果表明8批硫酸氫氯吡格雷片屬于晶型Ⅰ，3批屬于晶型Ⅱ，經(jīng)驗(yàn)證，該模型的靈敏度、專屬性、陰性預(yù)報(bào)性和檢出效率均良好。Hennigan等[58]利用透射拉曼光譜技術(shù)成功對(duì)吡拉西坦片劑中的FⅡ多晶型雜質(zhì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示雜質(zhì)含量占活性藥物成分(API)總含量的6%～7%。Lipi?inen等[59]以吡羅昔康為研究對(duì)象，對(duì)比了低頻和中頻拉曼光譜在藥物晶型定量中的檢測(cè)能力，吡羅昔康多晶型和水合物在低頻區(qū)和中頻區(qū)均顯示出明顯的光譜差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用低頻數(shù)據(jù)建立的定量模型預(yù)測(cè)性能更佳。

2.2 近紅外光譜技術(shù)

NIR光譜技術(shù)作為一項(xiàng)成熟的PAT技術(shù)，目前已在農(nóng)業(yè)、石油化工、食品加工以及制藥等領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用。NIR光譜主要記錄的是含氫基團(tuán)(C—H、O—H、N—H等)的倍頻和合頻吸收峰，往往用于反映待測(cè)物的整體信息[60]。該技術(shù)主要具有以下優(yōu)勢(shì)：①無(wú)損，檢測(cè)速度快;②光譜包含信息豐富，可用于定性定量分析;③檢測(cè)模式豐富，應(yīng)用范圍廣;④環(huán)境友好，污染小。近年來(lái)，NIR光譜技術(shù)在結(jié)晶過(guò)程在線監(jiān)控中也有研究報(bào)道，主要應(yīng)用于結(jié)晶度、晶型、晶體粒徑的監(jiān)測(cè)與調(diào)控。

Lee等[61]運(yùn)用NIR光譜技術(shù)對(duì)吲哚美辛的反溶劑結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，采用主成分分析對(duì)NIR光譜進(jìn)行分析，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)吲哚美辛反溶劑結(jié)晶過(guò)程中晶型和晶體粒徑的實(shí)時(shí)監(jiān)控。Ma等[62]以L-谷氨酸結(jié)晶過(guò)程為研究對(duì)象，采集了不同溶液濃度、不同粒徑和不同溫度的L-谷氨酸溶液NIR光譜，結(jié)合遺傳算法和支持向量機(jī)兩種方法建立校正模型，該模型成功應(yīng)用于L-谷氨酸冷卻結(jié)晶過(guò)程監(jiān)控。賈燕花等[63]采用NIR光譜技術(shù)測(cè)定不同相對(duì)結(jié)晶度的注射用頭孢曲松鈉樣品的NIR光譜，與使用XRD技術(shù)測(cè)定的樣品相對(duì)結(jié)晶度關(guān)聯(lián)并建立校正模型，用該模型預(yù)測(cè)49個(gè)廠家生產(chǎn)的49批樣品的相對(duì)結(jié)晶度，結(jié)果顯示模型預(yù)測(cè)結(jié)果與XRD技術(shù)測(cè)得的結(jié)果趨勢(shì)一致。

2.3 聚焦光束反射測(cè)量技術(shù)

隨著制藥工藝的需求，對(duì)晶體粒度的分析方法越來(lái)越多。結(jié)晶過(guò)程中顆粒晶體的粒度分布，不僅會(huì)對(duì)其堆密度和流動(dòng)性產(chǎn)生較大影響，進(jìn)而影響整個(gè)藥物生產(chǎn)過(guò)程的效率，并且對(duì)于最終藥物的儲(chǔ)存、生物利用度和溶出度的控制也至關(guān)重要[64]。然而，適合對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中晶體藥物的粒度進(jìn)行在線檢測(cè)的技術(shù)卻不多，目前最主流的在線檢測(cè)技術(shù)之一是FBRM。制藥工藝發(fā)展的需求促進(jìn)了FBRM技術(shù)在結(jié)晶過(guò)程粒度在線檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖3 HNIW結(jié)晶過(guò)程的在線監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖[69]Fig.3 Schematic diagram of HNIW crystallization process on-line monitoring experimental device[69]

FBRM是一種基于探針監(jiān)視的高效、準(zhǔn)確的結(jié)晶過(guò)程控制技術(shù)，可以有效識(shí)別顆粒的聚集和重疊等行為[65]。該技術(shù)通過(guò)測(cè)定激光束在與粒子接觸前后的光的反射時(shí)長(zhǎng)，測(cè)定出粒子的弦長(zhǎng)分布，從而確定粒子粒度，并通過(guò)反射數(shù)量確定晶體數(shù)量[66]。在結(jié)晶過(guò)程中，F(xiàn)BRM技術(shù)通常用于顆粒的成核過(guò)程和溶解過(guò)程的在線監(jiān)控，目前主要用于監(jiān)測(cè)成核和表征介穩(wěn)區(qū)寬度，以及監(jiān)測(cè)粒子生長(zhǎng)、聚結(jié)、微觀形貌等，同時(shí)還被廣泛用于溶液中顆粒數(shù)量和粒徑的監(jiān)測(cè)研究[67-68]。Yang等[69]聯(lián)用FBRM和RS技術(shù)對(duì)六硝基六氮雜異纖鋅烷(HNIW)的反溶劑結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，成功獲得HNIW多晶型的動(dòng)力學(xué)信息并對(duì)β晶型和ε晶型藥物濃度進(jìn)行表征，最終實(shí)現(xiàn)了HNIW在結(jié)晶過(guò)程中的成核動(dòng)力學(xué)和生長(zhǎng)速率的成功監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖3。Pandit等[70]運(yùn)用FBRM探針測(cè)得粒子數(shù)和粒子弦長(zhǎng)分布數(shù)據(jù)，通過(guò)簡(jiǎn)單的展開(kāi)工具直接從已知的弦長(zhǎng)分布測(cè)量值計(jì)算得到粒徑分布情況，為測(cè)試該粒徑分布預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性，使用對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)氨基苯酚雙晶體系對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示該模型的預(yù)測(cè)精度良好。孫苗[71]運(yùn)用FBRM技術(shù)對(duì)燈盞花素抗溶劑結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行全面、快速、高效的監(jiān)控，揭示了顆粒的形態(tài)、弦數(shù)以及弦長(zhǎng)分布，闡釋了抗溶劑結(jié)晶過(guò)程的3個(gè)階段和終點(diǎn)，有利于保障批次間質(zhì)量一致性和產(chǎn)品質(zhì)量。

2.4 X射線衍射技術(shù)

XRD是一項(xiàng)主要用于實(shí)時(shí)監(jiān)控抗生素等藥物的結(jié)晶及晶型轉(zhuǎn)變過(guò)程的PAT技術(shù)。其基本原理主要是根據(jù)X射線入射到晶體時(shí)，晶體中規(guī)則排列的晶胞中的原子間距離與入射X射線波長(zhǎng)有相同數(shù)量級(jí)，故由不同原子散射的X射線相互干涉，在某些特殊方向上產(chǎn)生強(qiáng)X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強(qiáng)度與晶體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[72]。運(yùn)用XRD技術(shù)監(jiān)控藥物結(jié)晶過(guò)程無(wú)需破壞樣品，且擁有較為成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析方法，測(cè)定結(jié)果具有較高的可靠性。汪佑宏等[73]以我國(guó)特有黃藤為研究對(duì)象，應(yīng)用XRD技術(shù)測(cè)定γ射線輻照前后纖維素中晶體的尺寸，探究晶體尺寸與物理力學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，隨著黃藤藤齡的減小，晶體寬度在1 901～3 019 nm范圍內(nèi)總體呈下降趨勢(shì)，晶體長(zhǎng)度在4 118～28 824 nm范圍內(nèi)變化，經(jīng)γ射線輻照后黃藤晶體寬度在2 139～3 540 nm范圍內(nèi)變化，晶體寬度變化范圍和平均值均有所增大，晶體長(zhǎng)度在5 765～38 432 nm范圍內(nèi)變化。針對(duì)天然纖維素的特殊晶體結(jié)構(gòu)和分峰法測(cè)量結(jié)晶度的影響因素問(wèn)題，劉治剛等[74]采用XRD技術(shù)擬合分峰法測(cè)定天然纖維素結(jié)晶度，探究無(wú)定型峰位置、峰形參數(shù)以及掃描范圍的選擇對(duì)結(jié)晶度測(cè)量的影響，確定擬合函數(shù)為pV，無(wú)定型峰位置為18°，掃描范圍為7°～40°時(shí)，天然纖維素結(jié)晶度的測(cè)定值重現(xiàn)性最好。Davis等[75]應(yīng)用XRD技術(shù)及高能同步輻射技術(shù)，對(duì)氟滅酸濕法造粒過(guò)程進(jìn)行在線監(jiān)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕法造?？墒狗鷾缢嵊山榉€(wěn)晶型向穩(wěn)定晶型轉(zhuǎn)變。

2.5 原位成像技術(shù)

2.5.1 粒子圖像測(cè)量技術(shù)多晶型是指某種藥物固體分子在結(jié)晶時(shí)具有2種或2種以上的分子構(gòu)型[76-77]。當(dāng)前市面上絕大多數(shù)固體藥物的存在方式均為晶體，藥物晶體的多晶型現(xiàn)象也隨之成為一個(gè)普遍存在的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著PVM技術(shù)在結(jié)晶過(guò)程在線監(jiān)控領(lǐng)域的快速發(fā)展，越來(lái)越多藥物的其他晶型被發(fā)現(xiàn)，它們的化學(xué)組分雖然一致，但由于形貌不同，導(dǎo)致不同晶型的藥物在物理或化學(xué)特性上產(chǎn)生顯著區(qū)別，包括藥物的保質(zhì)期、生物利用度、溶解度以及藥物效果等。甚至某些藥物由于晶型的改變，其藥性發(fā)生徹底的變化。所以，在藥物生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)PAT技術(shù)對(duì)藥物晶型進(jìn)行監(jiān)測(cè)與調(diào)控是非常重要的環(huán)節(jié)。在目前的晶型在線監(jiān)測(cè)研究中，常將PVM和FBRM兩種原位檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，通過(guò)結(jié)果反饋對(duì)晶型進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而得到需要的藥物晶體。

PVM是一種基于探針的高分辨率原位視頻顯微鏡。該技術(shù)通過(guò)6個(gè)獨(dú)立的激光源照射懸浮液以產(chǎn)生散射光，該散射光被電荷耦合器件(CCD)接收，然后通過(guò)相應(yīng)的設(shè)備將產(chǎn)生的圖像顯示在配套軟件上。該技術(shù)具有無(wú)需采樣以及離線分析的特點(diǎn)，可反映結(jié)晶過(guò)程的晶體形貌特征，通過(guò)連續(xù)生產(chǎn)高分辨率圖像以直觀地觀測(cè)晶體生長(zhǎng)情況。在結(jié)晶過(guò)程中，PVM通常用于表征顆粒的粒度、固體顆粒溶解、成核、生長(zhǎng)以及顆粒數(shù)量和形狀演化等，能夠準(zhǔn)確、直觀地對(duì)結(jié)晶過(guò)程中多晶型的轉(zhuǎn)變、聚結(jié)以及晶析等現(xiàn)象進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[78-79]，通過(guò)測(cè)定結(jié)果對(duì)結(jié)晶過(guò)程中的工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而得到制藥工藝需要的藥物晶體。

在結(jié)晶過(guò)程中，將FBRM與PVM兩種技術(shù)聯(lián)用具有以下優(yōu)點(diǎn)：①有效避免在測(cè)量過(guò)程中引入其他誤差;②實(shí)現(xiàn)對(duì)顆粒數(shù)量和粒徑進(jìn)行高重復(fù)性和高重現(xiàn)性的測(cè)量;③提高實(shí)驗(yàn)精確度及效率;④幫助使用者實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制晶體的晶型、粒徑和形狀，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)晶過(guò)程快速、多角度的研究。Kutluay等[80]分別用FBRM和PVM探針考察了停留時(shí)間、攪拌速度、進(jìn)料速度、過(guò)飽和度對(duì)硼酸晶體的晶型尺寸分布和晶體形狀的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了硼酸的成核速率和生長(zhǎng)速率。結(jié)果表明，攪拌速度對(duì)晶體弦長(zhǎng)分布和結(jié)晶習(xí)性有顯著影響。用PVM和顯微鏡對(duì)硼酸晶體的照片進(jìn)行了對(duì)比分析，該方法也可用于其他硼化合物的結(jié)晶過(guò)程研究。武潔花[81]用PVM和FBRM對(duì)頭孢唑林鈉的溶解過(guò)程進(jìn)行了表征，并成功實(shí)現(xiàn)頭孢唑林鈉晶型轉(zhuǎn)化過(guò)程的監(jiān)測(cè)。Jochen等[82]運(yùn)用4種不同的原位分析技術(shù)監(jiān)測(cè)L-谷氨酸溶劑介導(dǎo)的結(jié)晶過(guò)程，其中PVM和FBRM用于檢測(cè)晶體在轉(zhuǎn)化過(guò)程中的弦長(zhǎng)和形狀變化，RS技術(shù)用于監(jiān)測(cè)晶型轉(zhuǎn)變過(guò)程，ATR-FTIR技術(shù)則被用于監(jiān)測(cè)溶液濃度變化，將4種技術(shù)聯(lián)用很好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)L-谷氨酸結(jié)晶過(guò)程的在線監(jiān)控。

圖4 紅霉素二水合物(A)與PEG 6000(B)的晶型轉(zhuǎn)化過(guò)程[85]Fig.4 Crystal transformation process of EM(A) and PEG 6000(B)[85] *EM:erythromycin(紅霉素);PEG 6000:polyethylene glycol 6000(聚乙二醇6000)

2.5.2 熱臺(tái)偏光顯微鏡技術(shù)使用HSPM技術(shù)可在熱臺(tái)上進(jìn)行小規(guī)模結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)晶過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。該技術(shù)主要通過(guò)內(nèi)置數(shù)碼攝像頭記錄每一時(shí)刻的樣品狀態(tài)，然后根據(jù)晶體狀態(tài)信息對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行反饋并調(diào)節(jié)，使其按照預(yù)期方向發(fā)展。然而，HSPM通常只能得到抗生素等藥物晶型的信息，所以通常將其與其他技術(shù)聯(lián)用對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行在線分析與監(jiān)控[83]。Shyr等[84]將HSPM技術(shù)、調(diào)制差示掃描量熱法和實(shí)時(shí)廣角XRD技術(shù)聯(lián)用以研究LDA(L-lactide/D-lactide as-spun) 纖維和LDH(L-lactide/D-lactide hot-drawn) 纖維的均晶以及立體復(fù)合晶體在加熱過(guò)程中的結(jié)晶熔融行為、纖維形態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)演變，獲得了較好的效果。Mirza等[85]聯(lián)用HSPM、變溫X射線粉末衍射和調(diào)制差示掃描量熱法對(duì)紅霉素的多晶轉(zhuǎn)變行為進(jìn)行在線監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)紅霉素二水合物與聚乙二醇6000(PEG 6000)使用熱熔法生產(chǎn)固體分散體時(shí)會(huì)發(fā)生表面反應(yīng)(如圖4所示)，熔融過(guò)程中當(dāng)PEG 6000不存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致紅霉素二水合物的失水及晶型的轉(zhuǎn)變，研究者利用HSPM技術(shù)和在線XRD技術(shù)實(shí)現(xiàn)了晶型轉(zhuǎn)變過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有助于紅霉素二水合物結(jié)晶過(guò)程的調(diào)節(jié)與控制。

3 總結(jié)與展望

在制藥生產(chǎn)過(guò)程中，約有超過(guò)90%的藥物其藥效成分是以晶體的形式存在，對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行持續(xù)探索和研究，并最終實(shí)現(xiàn)結(jié)晶過(guò)程的可控可調(diào)是結(jié)晶領(lǐng)域目前及未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)[86]。近年來(lái)，PAT技術(shù)被廣泛運(yùn)用于結(jié)晶過(guò)程的在線監(jiān)測(cè)研究中，PAT技術(shù)的有效性、便捷性以及可靠性已得到業(yè)界研究人員的認(rèn)可。本文詳細(xì)介紹了目前主流的結(jié)晶過(guò)程PAT技術(shù)，例如ATR-FTIR、ATR-UV/Vis、NIR、RS等。并且介紹了這幾種技術(shù)在結(jié)晶過(guò)程監(jiān)測(cè)、多晶型研究、晶型轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用,表1列出上述技術(shù)的具體應(yīng)用和特點(diǎn)。PAT技術(shù)的應(yīng)用不僅有助于加深對(duì)結(jié)晶過(guò)程的理解，為結(jié)晶過(guò)程控制提供技術(shù)支持，而且已發(fā)展成相關(guān)領(lǐng)域研究中與傳統(tǒng)分析手段相輔相成的一門技術(shù)。但就目前而言，PAT技術(shù)的特異性較強(qiáng)，數(shù)據(jù)處理及分析難度偏高，對(duì)操作人員專業(yè)要求較高，所以促進(jìn)PAT技術(shù)的發(fā)展和普及，構(gòu)建學(xué)術(shù)界與企業(yè)界直至產(chǎn)學(xué)研的技術(shù)共享體系，使PAT技術(shù)得到真正意義上的普及與應(yīng)用具有重要意義。

表1 PAT技術(shù)在藥物結(jié)晶過(guò)程中的應(yīng)用與特點(diǎn)Table 1 Application and characteristics of PAT in pharmaceutical crystallization process