嚴曉,覃彩芳,李青先,秦玲,許文娟,樊伯珍

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院婦產科,上海 200062)

盆腔臟器脫垂(pelvic organ prolapse,POP)在中老年女性中常見,除排尿等障礙及局部潰瘍感染嚴重外很少會導致患者死亡,但顯著影響女性的生活質量。它是一個病程長、治療及研究等方面具有復雜性的疾病。文獻認為陰道分娩、絕經、年老、肥胖等均是POP發(fā)生的高危因素[1-2],但相關發(fā)病機理的基礎研究及各種臨床治療效果的病理生理機制仍不清,這些基礎研究及探討離不開穩(wěn)定的動物模型的建立。因此,如何制作合適的POP動物模型對于加深對其病因學和進展的認識以及研究有效的預防和治療策略有重要意義。本研究通過模擬妊娠難產產生的臟器支撐組織損傷和模擬絕經制備POP大鼠模型,并結合文獻試圖通過對模型大鼠生殖器表型,陰道前壁及子宮骶韌帶組織中膠原蛋白含量變化的觀察,來初步探討POP疾病動物模型制作的動物選擇、制作的動物模型的適用性以及研究中存在的問題,為不斷完善POP疾病動物模型制作提供研究積累。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6月齡SPF級雌性成年SD大鼠60只,體重約300 g,均已連續(xù)分娩過3次,另取同級別同齡無生育SD大鼠為對照,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供【SCXK(滬)2017-0005】,飼養(yǎng)于滬北實驗動物中心【SYXK(滬)2018-0034】。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度50%～60%,溫度控制在21～24℃。所有操作均符合實驗倫理學要求(批號:TJHBLAC-2019-026)。

1.1.2 試劑與儀器

RNA抽提試劑盒,美國zym公司生產。裂解液、逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒,日本TaKaRa株式會社生產。離心機(Thermo,美國),PCR基因擴增儀(Bio-Rad,美國),實時PCR擴增儀(Applied Biosysterms,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備

根據(jù)參考文獻進行造模[3-5]。取無生育史的45只成年SD雌性大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組,每組各15只。A組為正?？瞻讓φ战M,自由進食飲水飼養(yǎng)12周;B組為模擬絕經組,入組后常規(guī)飼養(yǎng)2周后單純雙側卵巢切除,術后飼養(yǎng)10周;C組為模擬產傷及絕經組,入組時即將大鼠腹腔注射麻醉,取俯臥位固定,將6F弗萊氏導尿管插入陰道中約3 cm,并往氣囊中注入生理鹽水3 mL撐開陰道,用1-0號絲線將導尿管八字縫合于陰道口,將大鼠固定,取恥骨聯(lián)合位于桌緣使導尿管下垂,給300 g拉力維持4 h后取出,常規(guī)飼養(yǎng)2周后行雙側卵巢切除,術后常規(guī)飼養(yǎng)10周;D組為增加模擬產傷強度組,取與上述各組入組研究時同齡的15只已連續(xù)分娩過3次的SD大鼠,同C組模擬產傷操作1次后間隔2周再行上述操作1次,常規(guī)飼養(yǎng)2周后行雙卵巢切除術,常規(guī)飼養(yǎng)8周。

1.2.2 標本采集及處理

各組隨機取8只,測量觀察各組大鼠實驗前后外陰表現(xiàn)和生殖道裂孔直徑的差異,并采用頸椎脫臼法將大鼠處死后,仰臥固定,打開盆腹腔,取出陰道前壁組織置于4%多聚甲醛溶液內固定48 h,脫水,石蠟包埋,待切片;取出大鼠骶韌帶組織,置于液氮內備用。

1.2.3 陰道前壁組織COL1A1,COL3A1,TGFβ-3表達水平的檢測

免疫組化方法檢測:常規(guī)固定,脫水,脫蠟后,以免疫組化法檢測陰道前壁組織中COL1A1,COL3A1,TGFβ-3的表達。大鼠陰道前壁組織切片脫蠟,水化后,枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原,加入抗COL1A1,COL3A1,TGFβ-3一抗(1∶100),4℃濕盒內孵育過夜。PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min后,加入二抗孵育,顯色,復染后,以顯微鏡觀察染色情況,拍攝圖片,HIS模式下,選取棕色或棕褐色陽性表達區(qū)域,以Image pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算積分光密度,每張切片取5個視野的光密度的平均值作為該切片的積分光密度值。

1.2.4 骶韌帶組織COL1A1,COL3A1,TGFβ-3表達水平的檢測

RT-PCR方法檢測:取各組樣本,用TRIzol裂解液和美國zymo公司生產的RNA抽提試劑盒提取總RNA,測總RNA濃度和純度,-80℃保存?zhèn)溆?。?μg的總RNA根據(jù)TaKaRa的逆轉錄試劑盒行cDNA逆轉錄,按照TaKaRa熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒操作步驟進行PCR反應;PCR反應在Real time PCR擴增儀上進行,反應條件:95℃,30 s,95℃,5 s,60℃,34 s,共45個循環(huán)。COL1A1(上游5′-GGTGAGACAGGCGAACAAGGTG-3′,下 游 5′-GCCAGGAGAGCCAGGAGGAC-3′),COL3A1(上 游5′-ACTTCTGGTCCTCCTGGTCTGC-3′, 下 游 5′-CGCCTGGCTCACCCTTTTCAC-3′),TGFCTG(上 游5′-CTGGCTCACCCTCATACCT-3′, 下 游 5′-CTGGCTCACCCTCATACCT-3′)的引物,由上海生工生物工程有限公司設計合成。各個基因的表達采用2-△△CT方法進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,計量資料采用平均值±標準差(±s)表示,兩組間比較采用團體t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外陰脫垂表型變化

與對照組A相比,C、D組大鼠陰道裂孔的直徑均超過A組大于2 mm;C、D組與A組之間陰道裂孔直徑差異具有顯著性[(1.403±0.343)相對(0.419±0.100)](P<0.05)、[(1.609±0.160)相對(0.419±0.100)](P<0.05)。各組大鼠沒有明顯的脫垂表型,D組表現(xiàn)出輕度的會陰體異常。

2.2 各組大鼠陰道前壁組織COL1A1、COL3A1和TGFβ-3免疫組化積分光密度比較

2.2.1 與A組比較

陰道前壁組織COL1A1的相對表達量B組和A組差異無顯著性,C組有下降趨勢,但差異無顯著性,D組顯著低于A組(P<0.05);COL3A1的相對表達量各組大鼠均表現(xiàn)為下降趨勢,C、D組均顯著低于A組(P<0.05)。TGFβ-3相對表達量與A組相比均呈上升趨勢,B組與A組間差異無顯著性,C、D組均顯著高于A組(P<0.05)(表1)。

2.2.2 組間比較

COL1A1的相對表達量隨著損傷強度的增加各組間有依次下降趨勢,但差異無顯著性。COL3A1的相對表達量C組較B組、D組較C組均呈顯著下降(P<0.05)。TGFβ-3相對表達量隨著損傷強度的增加C組較B組、D組較C組均顯著上升(P<0.05)(表1)。

2.3 各組大鼠骶韌帶組織COL1A1、COL3A1和TGFβ-3表達水平比較

2.3.1 與A組比較

骶韌帶組織COL1A1、COL3A1相對表達量均呈下降趨勢,其中B、C組與A組相比差異均無顯著性,D組顯著低于A組(P<0.05)。TGFβ-3相對表達量與A組相比均呈上升趨勢,B組與A組間差異無顯著性,C、D組均顯著高于A組(P<0.05)(表2)。

2.3.2 組間比較

COL1A1、COL3A1的相對表達量隨著損傷強度的增加C組較B組呈現(xiàn)下降趨勢,但差異無顯著性,D組較C組呈顯著下降(P<0.05);TGFβ-3相對表達量隨著損傷強度的增加C組較B組雖差異無顯著性,但有上升趨勢,D組較C組顯著上升(P<0.05)。

表1 各組大鼠陰道前壁組織COL1A1、COL3A1、TGFβ-3免疫組化積分光密度(±s)Table 1 Integral optical density of immunohistochemical staining of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in anterior vaginal wall of rats in each group(±s)

表1 各組大鼠陰道前壁組織COL1A1、COL3A1、TGFβ-3免疫組化積分光密度(±s)Table 1 Integral optical density of immunohistochemical staining of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in anterior vaginal wall of rats in each group(±s)

注:與A組比較,☆P<0.05;與B組比較,△P<0.05;與C組比較,□P<0.05。Note.Compared with Group A,☆P<0.05.Compared with Group B,△P<0.05.Compared with Group C,□P<0.05.

組別Groups COL1A1 COL3A1 TGFβ-3 A組Group A 51200±14459 172005±2079 84733±6054 B組Group B 53336±12744 168539±1957 84991±6161 C組Group C 50065±14125 135623±5407☆△ 90932±1146☆△D組Group D 44146±9568☆ 103268±4387☆□ 107597±4406☆□F 0.748 586.165 38.743 P 0.533 <0.05 <0.05

表2 各組大鼠骶韌帶組織COL1A1、COL3A1、TGFβ-3表達水平(±s)Table 2 mRNA expressions of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in sacral ligament tissues of rats in each group(±s)

表2 各組大鼠骶韌帶組織COL1A1、COL3A1、TGFβ-3表達水平(±s)Table 2 mRNA expressions of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in sacral ligament tissues of rats in each group(±s)

注:與A組比較,☆P<0.05;與C組比較,□P<0.05。Note.Compared with Group A,☆P<0.05.Compared with Group C,□P<0.05.

組別Groups COL1A1 COL3A1 TGFβ-3 A組Group A 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.06 B組Group B 0.99±0.02 0.99±0.04 0.99±0.07 C組Group C 0.96±0.04 0.97±0.02 1.22±0.13☆D組Group D 0.50±0.08☆□ 0.54±0.03☆□ 1.65±0.06☆□F 297.257 327.9 122.33 P<0.05 <0.05 <0.05

3 討論

女性盆腔臟器維持正常位置依賴于子宮骶韌帶等盆底支撐組織良好的解剖完整性、組織構成及其正常功能[6]。各種原因損傷的不能自愈的盆底局部解剖上的完整性常?？山柚F(xiàn)代不斷完善的外科手術而加以解決。而在組織學上,膠原蛋白I型和III型(COL1A1、COL3A1)在陰道壁及子宮骶韌帶的支持功能中扮演了重要的角色,近年來的研究提示,膠原蛋白含量減少引起這類支撐組織生物力學特征的改變是導致POP發(fā)生的重要原因[7-11]。POP疾病的形成過程緩慢,但多有前期引起盆底組織的急性損傷,這種急性損傷常常伴有一個自我修復的過程,TGFβ-3是參與創(chuàng)傷愈合修復反應的生長因子,能在轉錄、轉錄后及翻譯水平等多環(huán)節(jié)增加膠原蛋白的合成[12-14]。在探討POP疾病的形成過程及各種治療措施療效的基礎研究中,離不開選擇合適的POP動物模型的制作以及評價指標。目前尚沒有一種固定的POP動物模型能為這類研究使用?，F(xiàn)有的模型多集中在對壓力性尿失禁大鼠動物模型的制作,而這種模型是否適用于因骶韌帶為主引起的POP疾病的基礎研究中尚缺少文獻支持。本研究采用大鼠造模前后生殖器表型及陰道壁和骶韌帶中膠原蛋白及TGFβ-3的變化來評估其可靠性,以供該類研究制模參考。

現(xiàn)有制作POP模型的動物選擇主要有小鼠、大鼠、羊、兔子、靈長類動物和豬等。雖然大型動物如羊和靈長類動物(恒河猴等)等因為其與人類最接近的解剖和組織結構、病理生理、激素水平而被認為是POP最理想的制模動物,但存在生命周期長、研究費用高、研究場地限制等方面的困難[15]。嚙齒類動物如大鼠雖可能因為存在與人類解剖上的差異,但具有容易獲得、生命周期較短、數(shù)量多、經濟等優(yōu)點。有研究提示大鼠的陰道壁結構特征及支持組織與人類相似[16];妊娠及剛陰道分娩后的大鼠陰道壁線性剛度明顯下降,且是可逆的,4周后可恢復至正常[17];大鼠手術絕經模型因絕經大鼠陰道壁膠原蛋白呈下降趨勢[18]可作為研究POP的模型。但骶韌帶中這些結構成分的變化如何文獻報告尚少。近年來,有兩個在其他物種中有關骶韌帶的組織學方面的研究為POP骶韌帶研究的動物模型打下基礎,Gruber等[19]發(fā)現(xiàn)豬具有與人類相似的骶韌帶組織成分,適量而豐富的膠原蛋白和平滑肌,可以作為POP研究的動物模型。Iwanaga等[20]做了一個人類、大鼠、小鼠骶韌帶組織學方面的比較研究,提示比起小鼠,人類和大鼠的骶韌帶有更為相似的膠原和平滑肌含量,且大鼠骶韌帶樣本較小鼠大,雖然小鼠有基因敲除后其表型與人類臨床相似的優(yōu)點,但仍認為大鼠是一個POP骶韌帶相關研究更適合且經濟的動物模型來源。考慮到豬作為大型動物在飼養(yǎng)場地、操作等方面的困難,我們選取大鼠作為研究POP骶韌帶組織變化的模型無論從哪個角度判斷均較為合適。

目前壓力性尿失禁大鼠模型是在模擬產傷的基礎上聯(lián)合雙側卵巢切除法,因為這些方法模擬了妊娠難產和絕經,這符合壓力性尿失禁的重要發(fā)病因素。也同樣被認為是POP患者的主要發(fā)病原因,這種經典的方法為大家所應用。但研究表明由于大鼠特殊的盆底解剖特點,目前尚無自發(fā)性的POP方面的數(shù)據(jù)。同時妊娠和陰道分娩對于大鼠盆底支持組織生物力特征的影響存在自我修復,而雌激素減退對于盆底組織的影響也是個漫長的過程,選擇適時的研究指標檢測時機是判斷造模成功與否的關鍵。研究表明大鼠在分娩后4周[17],盆底支持組織可恢復至正常水平,而手術導致的絕經狀態(tài)始于雙側卵巢切除后15 d,之后雌激素水平會顯著下降[21]。所以本實驗中我們增加密產因素,每次分娩結束即開始下一次妊娠,且在前一次產傷的短期內即二周時再行產傷模擬操作,第2次模擬產傷2周后即行雙卵巢切除術,以增加產傷強度,術后再常規(guī)飼養(yǎng)動物8～10周,以增加模型的穩(wěn)定性及可重復性。

動物模型中盆腔臟器脫垂的客觀表型,有一個準確且可重復的量化系統(tǒng)是非常重要的。這樣的分級系統(tǒng)在大型動物模型如松鼠猴和狒狒的研究中已被使用[22-23]。在基因敲除的小鼠脫垂模型中也有一套盆腔器官脫垂量化(MOPQ)分級系統(tǒng)[24-25],這套分級系統(tǒng)中,0級和1級被定義為無脫垂表現(xiàn);2級或3級是中到重度脫垂;4級就是嚴重脫垂了。小鼠的脫垂牽涉到了一個會陰體的向外膨隆,而人類的脫垂是通過POP-Q分級系統(tǒng)客觀評估其外化表型。本研究結果提示采用本方法制作的大鼠模型沒有明顯的脫垂表型,D組表現(xiàn)出了一個輕度的會陰體異常,其生殖道裂孔較A組相比增加超過2 mm。但其表型特征表現(xiàn)為1級,如以表型變化為研究內容的研究本模型的制作并不合適。

另一方面,模型制作后其重要支撐組織中的組織成分變化為相關研究提供客觀的觀察指標,本研究中我們用免疫組化的方法測定I型和III型膠原蛋白在各組大鼠陰道前壁中的表達來協(xié)同判斷POP模型造模成功與否,提示大鼠陰道壁以III型膠原蛋白為主,這與既往研究一致[26]。隨著損傷強度的增加,與A組相比,各組III型膠原蛋白的表達均表現(xiàn)出了下降趨勢,其中D組的III型膠原蛋白的表達與A組相比存在著顯著性下降,這與人類中POP患者與非POP患者陰道壁中膠原含量有相似的變化[10,27-28],進一步說明了D組可以作為研究POP疾病病理生理機制的模型。另外,大鼠陰道前壁TGFβ-3的表達較A組的變化也都能進一步驗證。同樣,我們使用RT-PCR方法分析了骶韌帶中I型和III型膠原蛋白的含量,隨著損傷強度的增加,與A組相比,各組骶韌帶I型和III型膠原蛋白的表達有依次下降趨勢,其中D組骶韌帶I型和III型膠原蛋白的表達較A組均表現(xiàn)為顯著性下降(P<0.05)。TGFβ-3在骶韌帶中的表達隨著損傷強度的增加也呈上升趨勢,這可能是機體在損傷時的一種應急修復代償機制,這也與POP患者骶韌帶組織中I型和III型膠原蛋白以及TGFβ-3與非POP正常對照組相比時有著相似的變化[14,29-32],說明D組可以作為研究POP骶韌帶病理生理變化的動物模型。本組模型沒有脫垂表型可能與大鼠特殊的不同于人類的解剖有關,就像敲除了Hoxa11基因的小鼠與人類POP患者一樣表現(xiàn)出一個下降的膠原蛋白的表達,但是同樣沒有脫垂的表現(xiàn)[33-35]。

不難看出,隨著損傷強度的增加能得到我們預期的能作為研究POP骶韌帶病理生理變化的大鼠模型,且大鼠作為動物模型具有數(shù)量多、費用較低、生命周期短等優(yōu)點,但制作經過是一個耗時耗力的過程,麻醉次數(shù)多,且需要開腹手術,有麻醉意外、出血、感染等風險,大鼠死亡率高,造模成功率在70%左右,我們在制模入組時大鼠的量大于最后檢測標本的數(shù)量,就是基于以上風險考慮的。另外疾病的研究不局限于組織學方面的探索,還包括功能方面的研究,骶韌帶因其機械性能在盆底臟器正常位置的支持方面起著非常重要的作用,僅僅骶韌帶的組織成分的研究不能確定人類和其他物種的骶韌帶的機械性能具有相似性,而這恰恰是對POP機制研究是必須的,嚙齒類因其骶韌帶組織樣本的大小而限制了其機械性研究,這就決定了使用這類動物模型研究的相對局限性。

綜上所述,我們認識到沒有研究POP的動物模型是完美的,很多模型可以模擬人類的某個特征,比如組織、解剖或是激素,但沒有哪個動物模型能同時代表所有的特征。所以對各類動物行一個徹底的解剖、組織學和盆底韌帶等的組成及功能方面的研究,結合他們各自的優(yōu)缺點和需解決的實際研究問題,從而選擇最合適的動物模型開展相關研究。而本研究采用增加模擬產傷強度的基礎上聯(lián)合雙側卵巢切除法制作的大鼠模型,至少可以作為探索與POP骶韌帶組織膠原變化相關的病理生理變化的動物模型。