嚴(yán)宇青，沈超琴，陳豪燕，洪 潔，王震華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001

研究[1-2]顯示，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率及病死率分別位居惡性腫瘤的第3、4 位，是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大病因。CRC 患者的死亡與病灶轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，據(jù)統(tǒng)計(jì)患者因轉(zhuǎn)移而發(fā)生死亡的數(shù)量分別占初診和確診人數(shù)的25%和50%[3]。對于CRC 轉(zhuǎn)移的患者，切除原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶是最佳的治療方案，但由于癌癥細(xì)胞的潛伏性、播散性和抗藥性，患者于術(shù)后復(fù)發(fā)十分常見[4]。因此，對CRC 轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制及其診治標(biāo)志物的研究，已成為當(dāng)前關(guān)注的焦點(diǎn)。

在人類基因組中，細(xì)胞僅利用其中的2%來產(chǎn)生具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本，其余大部分不編碼蛋白質(zhì)的基因則被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。其中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本[5]。lncRNA 可定位在胞核內(nèi)或胞質(zhì)中。在分子水平上，lncRNA 通過不同機(jī)制調(diào)節(jié)染色質(zhì)組成、基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾[6]。在許多腫瘤尤其是惡性腫瘤中，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等[7-10]，lncRNA 的表達(dá)可發(fā)生改變。

基于此，我們假設(shè)有特定lncRNA 參與CRC 的轉(zhuǎn)移，通過篩選CRC 相關(guān)的lnc-MTBP-5，就該lncRNA 對人CRC 細(xì)胞侵襲能力的影響進(jìn)行檢測，以期為CRC 的早期診斷及治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

1.1.1 數(shù)據(jù)集獲取 從SRA（Sequence ReadArchive）數(shù)據(jù)庫中提取PRJNA218851 數(shù)據(jù)集和PRJNA376161 數(shù)據(jù)集。前者包括18 例CRC 患者的正常結(jié)腸黏膜、CRC 原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)據(jù)，后者包括10 對腫瘤組織和正常結(jié)腸組織、5 對異常隱窩灶和匹配普通隱窩灶的數(shù)據(jù)。SRA數(shù)據(jù)庫信息均采用R3.5.2 軟件提取，用以篩選與CRC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA。

1.1.2 組織芯片數(shù)據(jù)獲取 在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中提取含有638 例CRC 組織芯片和51 例正常結(jié)直腸組織芯片的數(shù)據(jù)，分析lnc-MTBP-5在正常結(jié)直腸組織和CRC 組織中的表達(dá)差異。根據(jù)lnc-MTBP-5在CRC 患者癌組織表達(dá)量的中位數(shù)，將TCGA 數(shù)據(jù)庫中的638 例患者分為lnc-MTBP-5高表達(dá)組和lnc-MTBP-5低表達(dá)組。從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取CRC 患者的臨床信息，包括初次病理診斷年齡、性別、美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）臨床分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管侵及、結(jié)腸息肉病史和治療后復(fù)發(fā)，分析lnc-MTBP-5與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性。TCGA 數(shù)據(jù)庫CRC 組織芯片信息均采用R3.5.2軟件提取。

1.2 標(biāo)本收集

選擇2016 年1 月—2017 年12 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的53 例CRC 手術(shù)患者，從癌組織和癌旁組織獲取標(biāo)本，并于-80 ℃長期保存。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)為[2015]097），所有參與者均簽署了知情同意書。

1.3 細(xì)胞和主要試劑

人正常結(jié)直腸黏膜FHC 細(xì)胞以及人CRC 細(xì)胞HT29、SW480、DLD1、HCT116、SW1116、Lovo、RKO 和Caco2 均購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI-1640 培養(yǎng)液、McCoy's 5A 培養(yǎng)液、OptiMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco 公司，DharmaFECT 1 轉(zhuǎn)染試劑購自美國GE Healthcare 公司，RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購自日本TaKaRa公司，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CCK-8 檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Transwell 小室購自美國Millipore 公司，Matrigel 膠購自美國BD Bioscience 公司。

1.4 CRC 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

分別采用含5%胎牛血清的McCoy's 5A 完全培養(yǎng)基和RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT29、SW480 細(xì)胞，于3 d 后傳代。待細(xì)胞生長至指數(shù)生長期時(shí)，分別以3×105個(gè)/孔、2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。

用Control siRNA、lnc-MTBP-5siRNA 分 別 轉(zhuǎn) 染HT29 和SW480 細(xì)胞，并用正常表達(dá)lnc-MTBP-5的質(zhì)粒（pcDNA3.1）、lnc-MTBP-5過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-lnc-MTBP-5）分別轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞。于6 孔板中繼續(xù)分別培養(yǎng)上述細(xì)胞24 h 后，將培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)基。于37 ℃培養(yǎng)6 h 后將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h 后提取RNA，用于后續(xù)研究。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)siRNA 序列見表1。

表1 siRNA 序列Tab 1 Sequence of siRNA

1.5 細(xì)胞和組織中l(wèi)nc-MTBP-5 的表達(dá)量檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測lnc-MTBP-5的表達(dá)量。采用磷酸鹽緩沖液洗滌FHC 細(xì)胞、8 種CRC 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染的HT29、SW480 細(xì)胞各2 次，同時(shí)將53 例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織標(biāo)本研磨成粉末后，按照操作說明抽提總RNA。細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核RNA 抽提按照試劑盒說明操作。分別取1 μg 上述RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、StepOne real-time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行qPCR 檢測。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-△△CT值評估基因的相對表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞、組織中總表達(dá)量的檢測以GAPDH為相對內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)量檢測以U6為相對內(nèi)參。引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab 2 Primer sequences for PCR

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測

采用CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測CRC 細(xì)胞的增殖能力。將HT29、SW480 細(xì)胞接種至96 孔板中，按1.4 方法分別轉(zhuǎn)染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA。分別在轉(zhuǎn)染后的第0、1、2、3、4 日，向每孔加入100 μL 含10% CCK8試劑的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測定樣品在450 nm 處的吸光度。

1.7 細(xì)胞克隆形成能力檢測

采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CRC 細(xì)胞的增殖能力。將HT29、SW480 細(xì)胞以800 個(gè)/孔接種至6 孔板中，按1.4方法分別轉(zhuǎn)染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，并靜置于培養(yǎng)箱中。7 d 后棄去培養(yǎng)基，經(jīng)固定染色后拍照，觀察克隆形成的大小和數(shù)量。

1.8 細(xì)胞侵襲能力檢測

采用侵襲實(shí)驗(yàn)檢測SW480 細(xì)胞的侵襲能力。將SW480 細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后向其中分別轉(zhuǎn)染Control siRNA 和lnc-MTBP-5siRNA，以及對照質(zhì)粒和lnc-MTBP-5過表達(dá)質(zhì)粒。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行消化，并用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。在24 孔培養(yǎng)板中放入Transwell 小室，鋪入40 μL Matrigel；4 ～6 h 后向小室下層加入600 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，小室上層加入200 μL 上述4 組細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后取出小室，固定染色并于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨機(jī)選取4 個(gè)視野（放大倍數(shù)為40 倍），計(jì)數(shù)穿過Matrigel 的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。組間比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRA 數(shù)據(jù)庫中與CRC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA 分析

采用t檢驗(yàn)對PRJNA218851 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，共獲得105 條[假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05）]在正常-原發(fā)灶-轉(zhuǎn)移灶中依次表達(dá)上調(diào)的lncRNA；在PRJNA376161 數(shù)據(jù)集中，對10 對腫瘤組織和癌旁正常組織的數(shù)據(jù)分析得到990 條（FDR＜0.05）差異表達(dá)lncRNA。對上述lncRNA 取交集，共得到10 條在2 個(gè)數(shù)據(jù)集中均有意義的lncRNA。通過在UCSC（http://genome.ucsc.edu/）中比對序列，我們將關(guān)注點(diǎn)放在ENSG00000254814、ENSG00000257453 和ENSG00000272502 這3 條lncRNA上，篩選流程如圖1A。由于前2 條lncRNA 的引物未能成功合成，因此僅重點(diǎn)研究ENSG00000272502。通過在LNCipedia 數(shù)據(jù)庫（https://lncipedia.org/）中對該lncRNA的編碼潛能進(jìn)行驗(yàn)證（排除假陽性），最終確認(rèn)其（lnc-MTBP-5）是一種非編碼RNA（圖1B）。

在正常腸上皮細(xì)胞和8 個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中對lnc-MTBP-5表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示lnc-MTBP-5在5 個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于FHC 細(xì)胞（圖1C）。通過對HT29、SW480 細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核RNA 進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，lnc-MTBP-5在胞質(zhì)、胞核中均有分布（圖1D、E）。

圖1 SRA 數(shù)據(jù)庫中與CRC 轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA 分析Fig 1 Analysis of lncRNAs related to CRC metastasis in SRA database

2.2 lnc-MTBP-5 在CRC 患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異

為了探討lnc-MTBP-5與CRC 的臨床相關(guān)性，本研究對53 例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織標(biāo)本中l(wèi)nc-MTBP-5的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2A）顯示癌組織中l(wèi)nc-MTBP-5的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P=0.000）。進(jìn)一步針對TCGA數(shù)據(jù)庫中638 例癌組織和51 例正常組織中的lnc-MTBP-5表達(dá)進(jìn)行評估，結(jié)果（圖2B）顯示癌組織中其表達(dá)高于正常組織（P=0.000）。繼而提示，lnc-MTBP-5的高表達(dá)可能參與了CRC 的發(fā)生和發(fā)展。

2.3 CRC 組織中l(wèi)nc-MTBP-5 表達(dá)與患者臨床預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步驗(yàn)證lnc-MTBP-5與CRC 的臨床相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)在TCGA 數(shù)據(jù)庫的638 例患者中，lnc-MTBP-5表達(dá)的高低與患者的初次病理診斷年齡（P=0.020）、臨床分期（P=0.006）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.017）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（P=0.033）有關(guān)（表3）；且與低表達(dá)組相比，lnc-MTBP-5高表達(dá)組中初次病理確診年齡小于65 歲以及臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者居多，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

圖 2 lnc-MTBP-5 在正常結(jié)直腸組織與CRC 組織中的表達(dá)Fig 2 Expressions of lnc-MTBP-5 in CRC tissues and normal colorectal tissues

表3 CRC 患者中l(wèi)nc-MTBP-5 表達(dá)與臨床信息的關(guān)系Tab 3 Relationship between lnc-MTBP-5 expression and clinical information in patients with CRC

2.4 lnc-MTBP-5 對CRC 細(xì)胞侵襲能力的影響

為評估lnc-MTBP-5在CRC 發(fā)生與發(fā)展中的生物學(xué)功能，本研究通過向HT29、SW480 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染lnc-MTBP-5siRNA 發(fā)現(xiàn)，lnc-MTBP-5的表達(dá)量顯著下降；而在SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lnc-MTBP-5后發(fā)現(xiàn)，lnc-MTBP-5的表達(dá)量顯著升高（圖3A ～C）。隨后，進(jìn)一步開展功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HT29 和SW480 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染lnc-MTBP-5siRNA后，與轉(zhuǎn)染Control siRNA 的細(xì)胞相比，前者的增殖和克隆形成能力無明顯差異（圖3D、E）。因HT29 是高分化型CRC 細(xì)胞系，侵襲能力較弱，侵襲功能實(shí)驗(yàn)僅選擇低分化的SW480 細(xì)胞系進(jìn)行。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)lncRNA siRNA 轉(zhuǎn)染的SW480 細(xì)胞穿過Transwell 小室的數(shù)量少于經(jīng)Control siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（圖3F）。相反，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的SW480 細(xì)胞相比，上調(diào)lnc-MTBP-5后，SW480 細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)（圖 3G）。以上結(jié)果表明，lnc-MTBP-5可以增強(qiáng)SW480 細(xì)胞的侵襲能力，但對HT29 和SW480 細(xì)胞的增殖和克隆形成能力無明顯影響。

2.5 lnc-MTBP-5 與轉(zhuǎn)移起始基因表達(dá)的相關(guān)性

轉(zhuǎn)移起始基因的缺失或過表達(dá)均能促使細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞黏附的減少、細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)、血管生成以及腫瘤微環(huán)境的改變[11]。為進(jìn)一步探索lnc-MTBP-5的作用機(jī)制，本研究對TCGA 數(shù)據(jù)庫中l(wèi)nc-MTBP-5的表達(dá)與轉(zhuǎn)移起始基因的表達(dá)做相關(guān)性分析。結(jié)果（圖4）顯示，lnc-MTBP-5與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC1）呈正相關(guān)；經(jīng)進(jìn)一步探索其下游機(jī)制發(fā)現(xiàn)，lnc-MTBP-5與間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、鈣黏著蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（cadherin-associated protein，CTNNB1）均呈正相關(guān)，而與肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）均無明顯正相關(guān)性。繼而提示，lnc-MTBP-5促進(jìn)CRC 的轉(zhuǎn)移可能與MACC1 激活HGF/MET 通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有關(guān)。

圖3 lnc-MTBP-5 在CRC 發(fā)生與發(fā)展中的生物學(xué)功能Fig 3 Biological function of lnc-MTBP-5 in the occurrence and development of CRC

圖4 lnc-MTBP-5 與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 4 Correlation analysis of lnc-MTBP-5 and the expression of metastasis associated genes

3 討論

研究[12-13]顯示，CRC 的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，且其病灶轉(zhuǎn)移是CRC 患者死亡的主要原因。因此，針對CRC 轉(zhuǎn)移的早期檢測，并尋找有效的分子標(biāo)志物成為近年來預(yù)防和治療CRC 的關(guān)鍵點(diǎn)。

已有研究報(bào)道，CRC 的轉(zhuǎn)移與許多分子標(biāo)志物相關(guān)，如JMJD2C、FOXC1、SGK1、RHBDD1[14-17]。同時(shí)，非編碼RNA 也被廣泛報(bào)道參與了CRC 轉(zhuǎn)移的發(fā)生。依據(jù)RNA 長度的不同，非編碼RNA 被分為兩類；其中，小于200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本被稱為microRNA，通常在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；而大于200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本被稱為lncRNA，該類RNA 具有較強(qiáng)的組織和細(xì)胞表達(dá)特異性，參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞活動(dòng)，如募集染色質(zhì)修飾物（HOTAIR）[18]、調(diào)節(jié)X 染色體基因表達(dá)（XIST）[19]、調(diào)節(jié)基因組表達(dá)和蛋白質(zhì)活性等。此外，lncRNA 還具有結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，易于在血液和尿液中被檢測，且定量方法靈敏、快速、成本低廉等優(yōu)勢[20]，使得該類RNA 可作為癌癥初篩、早期診治的分子標(biāo)志物，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

在本研究中，通過整合分析2 個(gè)SRA 數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)，篩選出在正常-原發(fā)灶-轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)依次上調(diào)的lncRNA，通過結(jié)合文獻(xiàn)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、臨床標(biāo)本信息的驗(yàn)證，我們選擇了lnc-MTBP-5繼續(xù)研究；結(jié)果顯示，該lncRNA 在多個(gè)CRC 細(xì)胞系和CRC 組織中均呈高表達(dá)。同時(shí)，本研究通過提取TCGA 數(shù)據(jù)庫中CRC 患者的臨床信息進(jìn)行研究，結(jié)果顯示lnc-MTBP-5的表達(dá)量與患者預(yù)后緊密相關(guān)。繼而推測，lnc-MTBP-5或可作為早期預(yù)警和診斷CRC 的分子標(biāo)志物；由于高表達(dá)lnc-MTBP-5的患者易發(fā)生CRC 轉(zhuǎn)移，臨床醫(yī)師應(yīng)在患者早期給予積極治療，手術(shù)后密切隨訪。

CRC 的肝轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素之一，因此揭示CRC 轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制亦是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究通過下調(diào)lnc-MTBP-5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SW480 細(xì)胞的侵襲能力減弱，繼而證實(shí)lnc-MTBP-5的高表達(dá)可提高CRC 的轉(zhuǎn)移能力。

先前已有研究表明lncRNA 在CRC 中呈現(xiàn)異常表達(dá)，但有關(guān)其在CRC 轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制仍知之甚少。目前，基于lncRNA 在序列、結(jié)構(gòu)以及生物功能上的高度異質(zhì)性，存在有多種lncRNA 的分類方法，如根據(jù)亞細(xì)胞定位可將lncRNA 分為細(xì)胞核lncRNA 與細(xì)胞質(zhì)lncRNA。lncRNA 的亞細(xì)胞定位與其功能密切相關(guān)，如在細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與microRNA 競爭性結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA抑制的靶基因表達(dá)[21]。已有研究[22]報(bào)道，lncRNAUICLM通過競爭性結(jié)合miR-215 來調(diào)節(jié)其下游ZEB2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CRC 的肝轉(zhuǎn)移。lncRNAXIST可直接結(jié)合miR-200b-3p，調(diào)節(jié)其下游ZEB1的表達(dá)，從而促進(jìn)CRC 細(xì)胞的增殖、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及小鼠模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[23]?？紤]到本研究中l(wèi)nc-MTBP-5在胞質(zhì)、胞核均有分布，我們推測lnc-MTBP-5可通過競爭性結(jié)合相關(guān)microRNA，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)CRC 的轉(zhuǎn)移。

癌癥的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞黏附性的降低、癌細(xì)胞的黏附性增加和腫瘤微環(huán)境的改變等[24-28]，是許多腫瘤發(fā)展、侵襲的重要過程[29-30]。根據(jù)在轉(zhuǎn)移中所起的作用，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因可分為促癌基因、轉(zhuǎn)移起始基因、轉(zhuǎn)移進(jìn)展基因和轉(zhuǎn)移毒力基因[11]。轉(zhuǎn)移起始基因MACC1已被證實(shí)在惡性腫瘤組織中有較高的表達(dá)，尤其在發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性組織中。MACC1可通過結(jié)合Met的啟動(dòng)子區(qū)，激活HGF/MET 通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和凋亡[31-32]。HGF/MET 通路的激活可使其下游的相應(yīng)信號(hào)通路被激活，如通過TWIST/VEGF 通路促進(jìn)血管生成，激活Nanog 分子增強(qiáng)細(xì)胞干性，激活STAT1/3、MCL1/FAS調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和免疫重建。其中，AKT/CTNNB1 通路是HGF/MET 通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的中間信號(hào)通路。本研究初步分析了TCGA 數(shù)據(jù)庫中l(wèi)nc-MTBP-5與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)lnc-MTBP-5促進(jìn)CRC 的轉(zhuǎn)移可能與MACC1 激活HGF/MET通路及其下游AKT/CTNNB1 通路有關(guān)。結(jié)合lnc-MTBP-5在胞質(zhì)、胞核的分布，我們推測lnc-MTBP-5可能通過競爭性結(jié)合microRNA 提高M(jìn)ACC1 的表達(dá)，進(jìn)而激活下游AKT/CTNNB1 通路。而其具體機(jī)制還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步 探究。

綜上所述，lnc-MTBP-5在CRC 中表達(dá)增加，且其高表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)，lnc-MTBP-5可促進(jìn)CRC 細(xì)胞的侵襲。因此，lnc-MTBP-5或可作為臨床評估CRC 發(fā)生與發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的新型腫瘤標(biāo)志物，其相關(guān)信號(hào)通路及分子機(jī)制亦將是我們下一步的研究重點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，lnc-MTBP-5或可為臨床預(yù)防、治療CRC 及相關(guān)預(yù)后評估提供更加廣闊的前景。

參·考·文·獻(xiàn)

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