袁寶玉，武強，周聰，張慧，徐茂鎖，齊偉強，沈芳

復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院檢驗科，上海200240

艱難梭菌(clostridium difficile) 是醫(yī)院感染重要病原菌[1]，若未及時控制，可能導致患者住院時間延長、病死率升高、醫(yī)療費用增加。已有研究表明無癥狀攜帶者與艱難梭菌傳播及感染暴發(fā)密切相關(guān)[2,3]。目前我國人口老齡化問題日趨嚴重，Ⅱ型糖尿病是老年人常見病、多發(fā)病。關(guān)于老年患者，特別是老年糖尿病患者艱難梭菌無癥狀攜帶情況研究少見。本研究對老年Ⅱ型糖尿病住院患者糞便樣本進行艱難梭菌分離與鑒定，初步探討其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 一般資料 收集2019年3月-11月復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科264 例≥60 歲Ⅱ型糖尿病住院患者。診斷標準[4]：典型糖尿病癥狀(煩渴多飲、多尿、多食、不明原因體重下降) 加隨機血糖≥11.1mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或葡萄糖負荷后2h 血糖≥11.1 mmol/L。排除標準：(1) 其他類型糖尿?。?2) 嚴重肝腎功能不全；(3) 心、腦、呼吸系統(tǒng)等嚴重疾病。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 材料 艱難梭菌CDMN 選擇性培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)；DNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)；PCR 試劑盒(日本TaKaRa 公司)；PCR 擴增儀(德國Eppendorf 公司)；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析儀(德國Bruker Daltonics 公司)；引物設計和測序(生工生物工程(上海) 股份有限公司)；XN9000 全自動五分類血液分析儀及配套試劑(日本Sysmex 公司)；Cobas 8000 全自動生化免疫分析儀及配套試劑(瑞士羅氏公司)。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離、培養(yǎng)及鑒定 取1g 新鮮糞便樣本置于離心管中，加入等體積無水乙醇，震蕩，3 500 r/min離心15min，取沉淀接種于CDMN 平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24～48h，每平板挑3～5 個典型菌落用質(zhì)譜儀鑒定并保存菌株。所有操作均按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4 版) 規(guī)程[5]。

1.3.2 PCR 檢測毒素基因 提取糞便樣本中艱難梭菌DNA，參考文獻[6-8]合成引物，擴增16S rDNA 基因、毒素基因tcdA 和tcdB、二元毒素基因cdtA 和cdtB，用瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.3 多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST) 參考文獻[7]擴增adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpiA 7 個管家基因，外送測序，將結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對，獲得等位基因數(shù)，判斷序列型(Sequence Type, ST)。用BioNumerics 7.6 軟件作最小生成樹圖，進行進化分析。

1.3.4 研究對象臨床信息采集 借助醫(yī)院LIS 和HIS 平臺收集研究對象個人信息(年齡、性別、糖尿病史等)和實驗室信息(血常規(guī)、生化指標等)。

1.4 統(tǒng)計分析 應用stata 13 軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本 檢驗，以Mean±SD 表示；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，以中位數(shù)和四分位間距(P25-P75) 表示；計數(shù)資料采用檢驗，以例數(shù)和百分比(n,%)表示。＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 老年Ⅱ型糖尿病住院患者艱難梭菌分離培養(yǎng)和鑒定情況 從264 份糞便樣本中，培養(yǎng)出艱難梭菌52株，陽性率為19.70%。經(jīng)PCR 檢測毒素基因，1 株為非產(chǎn)毒艱難梭菌，51 株產(chǎn)毒，產(chǎn)毒基因攜帶率為98.08% (51/52)。其中毒素A 陰性、毒素B 陽性、二元毒素陰性(A-/B+/二元-) 菌株15 株(29.41%)，毒素A、B 陽性、二元毒素陰性(A+/B+/二元-) 菌株34 株(66.67%)，毒素A、B、二元毒素均為陽性(A+/B+/二元+) 菌株2 株(3.92%)。

2.2 51 株艱難梭菌分離株MLST 情況 對從老年Ⅱ型糖尿病患者樣本中分離的艱難梭菌進行MLST，檢出20 種ST，其中48 株為已知ST 菌株，分屬于17 個不同ST，ST81 最常見，占23.53%，其他比較常見的是ST2 (19.61%)、ST3 (11.76%) 和ST54 (7.84%)，同時發(fā)現(xiàn)3 個新的、未被報道的ST 型，檢出1 株ST37，未檢出ST1。對其進行進化分析，ST81 與ST37親緣關(guān)系較近，與其余ST 親緣關(guān)系較遠，具體見圖1。

2.3 老年Ⅱ型糖尿病患者部分臨床資料 與艱難梭菌未檢出組相比，檢出組住院時間偏長、外周血中性粒細胞計數(shù)和百分比偏高，C 反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、肌酐水平較高，淋巴細胞計數(shù)和百分比、白蛋白、前白蛋白水平較低，差異有統(tǒng)計學意義＜0.05)。兩組年齡、性別構(gòu)成、糖尿病病程、白細胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義＞0.05)，具體見表1。

3 討論

正常成人艱難梭菌攜帶率為1%～7%[7]。本研究老年Ⅱ型糖尿病患者艱難梭菌陽性率為19.70%(52/264)，高于正常成人攜帶率。我們用PCR 檢測毒素基因，陽性率為98.08%(51/52)，即檢出艱難梭菌多為產(chǎn)毒株。毒素與腸上皮細胞受體相互作用，可導致細胞凋亡、炎性細胞浸潤, 產(chǎn)生腸毒性和細胞毒性[9]。所以部分無癥狀攜帶者可在病情變化、抗菌藥物暴露等情況下發(fā)生艱難梭菌感染，應引起醫(yī)護人員警惕。

為了解艱難梭菌在老年Ⅱ型糖尿病患者中的分子流行病學特點，本研究進行了MLST，發(fā)現(xiàn)ST81 是最主要的型別，與Qin 等[10]的研究ST81 分離率最高，占30.8% (28/91) 相似，分析原因可能是該菌株高抗生素抗性，低毒力及老年糖尿病患者免疫功能低下。其他常見型別是ST2、ST3 和ST54，與Jin 等[11]對我國華東地區(qū)的研究結(jié)果一致。本研究未檢出造成高病死率、高復發(fā)率的艱難梭菌ST1[12]，卻檢出1 株曾在亞太地區(qū)流行甚至暴發(fā)的ST37[13]，應引起重視。

本文比較老年Ⅱ型糖尿病患者的臨床特點，發(fā)現(xiàn)檢出組住院時間相對延長(＜0.05)，與上海瑞金醫(yī)院研究結(jié)果相似，60 歲及以上艱難梭菌感染患者住院時間高于未感染患者[(1811) d，＜0.05][14]，提示攜帶艱難梭菌的老年Ⅱ型糖尿病患者可能健康狀況受到影響，需引起關(guān)注。

表1 組間臨床資料比較[Mean±SD，中位數(shù)(P25-P75)，n(%)]

美國醫(yī)療衛(wèi)生流行病學會和美國傳染病學會2017年臨床實踐指南指出：白細胞和血清肌酐水平升高可作為判斷艱難梭菌感染嚴重程度的參考指標[2]，而本研究觀察到兩組白細胞總數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)，但檢出組白細胞分類中的中性粒細胞總數(shù)和百分率偏高，淋巴細胞計數(shù)和百分比偏低，且CRP增高有統(tǒng)計學意義(＜0.05)，提示老年Ⅱ型糖尿病艱難梭菌檢出者，可能存在炎癥反應，免疫力偏弱。

既往研究顯示血清白蛋白水平與艱難梭菌檢出有關(guān)[14]，本研究中也觀察到白蛋白、前白蛋白水平相對較低(＜0.05)，提示可能肝細胞合成蛋白功能受影響。此外，檢出組血清肌酐水平高于未檢出組，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)，提示可能腎小球濾過功能也受影響。即老年Ⅱ型糖尿病患者攜帶艱難梭菌，可能影響肝腎功能。

本院老年Ⅱ型糖尿病患者艱難梭菌檢出率高、產(chǎn)毒株占比高。艱難梭菌檢出組外周血中性粒細胞、CRP、肌酐水平偏高；淋巴細胞、白蛋白、前白蛋白水平偏低。當血液炎癥及肝腎功能指標趨于異常時，建議對以上患者進行艱難梭菌篩查及毒素檢測，以及早干預，降低風險。本研究存在一定局限性，如樣本數(shù)量少，選擇區(qū)域小，未進行藥敏試驗。下一步將聯(lián)合其他多家醫(yī)院進行更深入研究。