武韞，呂帆真，吳越，牛玉旭，高文

復旦大學附屬華東醫(yī)院胸外科，上海200040

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，近年來，肺癌在我國發(fā)病率快速增長，達到26.9%，已是我國發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1]。隨著患病人數(shù)的增加，老年患者患病的比例也逐漸增多，此類患者具有一般情況差，合并癥多，無法耐受放化療等特點，因此預后往往不良[2]。近年來，隨著以靶向治療與免疫藥物的廣泛推廣應用，肺癌患者的生存率有所提高，但由于腫瘤異質(zhì)性的存在，大部分患者在用藥后會出現(xiàn)耐藥。如何在影像學進展前有效地判斷疾病進展，從而給予提前干預，是老年非小細胞肺癌患者亟需解決問題。近年來，液體活檢在肺癌診療過程中廣泛應用[3]，其中，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）檢測其具有檢測方便，檢測過程中創(chuàng)傷小，且具有可重復檢測的優(yōu)點。是目前腫瘤診斷治療中的研究熱點。本研究擬將CTC 形態(tài)學分析應用于老年非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的預后判斷，擬為老年NSCLC 患者的診療提供新的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象 本研究回顧性分析了2017年1月-2019年12月在復旦大學附屬華東醫(yī)院接受肺癌手術的312例老年患者，入選標準為：（1）病理證實的原發(fā)性非小細胞肺癌，一般基線資料完整；（2）年齡≥70 歲；（3）術前CTC 檢測陽性；（4）術中能夠獲取肺癌組織及對照癌旁組織，所獲取標本能即刻進行液氮（-80°C）儲存；排除標準為：（1）臨床隨訪資料不完整；（2）術前未能檢測到CTC；（3）既往惡性腫瘤病史、嚴重感染、肝功能不全、出凝血功能障礙的患者。

1.2 病例數(shù)據(jù)收集及隨訪 術后收集數(shù)據(jù)包含一般基線資料，具體包括：性別、年齡、病理分級、TNM 分級（IASLC 第7 版）[4]等。以OS 與DFS 評估患者的術后生存狀況。術后2年患者，每3月隨訪胸部CT、B 超、腫瘤標志物，每半年隨訪骨掃描及頭顱MRI；術后第3年病例，每半年隨訪以上胸部CT、B 超、腫瘤標志物，每年隨訪骨掃描及頭顱MRI。

1.3 CTC 捕獲及形態(tài)學分析 人外周血CTC 檢測、富集試劑盒購買自上海頓慧醫(yī)療科技有限公司。CTC 檢測及富集參考文獻[5]。利用抗凝管采集術前患者靜脈血5 mL, 混勻，血漿分離、紅細胞裂解、白細胞分離、涂片自然干燥、免疫熒光染色。CTC 判定標準為：DAPI (+)，EPCAM/CK (+)，CD45 (-)；將分離的CTC細胞利用圖像綜合處理系統(tǒng)，測量所獲得CTC細胞直徑，根據(jù)細胞直徑數(shù)值的中位數(shù)，將所捕獲CTC 分為大細胞型CTC (large size CTC L-CTC) 組和小細胞型CTC (small size CTC；S-CTC) 組；

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用中位數(shù)或4 分位數(shù)間距表示，組間比較采用 檢驗, 技術資料采用或Fisher's 精確檢驗；不符正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用用Mann-Whittle 檢驗。Kaplan-Meier 法計算總生存率(OS) 及預后價值判斷采用log-rank 對數(shù)秩和檢驗, Cox 比例風險模型進行多因素生存分析；＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本研究共納入患者108 例，中位隨訪時間為22個月。年齡范圍70～81 歲，平均年齡（73.8±3.7）歲，其中女性59 例，男性59 例。具吸煙或吸煙史患者26例?；赥NM 分級將患者進行分期，其中I 期患者12 例，II 期患者39 例，III 期患者39 例，IV 期患者18 例；中位CTC 數(shù)為4 個，利用圖像處理系統(tǒng), 將獲得的CTC 根據(jù)細胞直徑數(shù)值的中位數(shù)（(6m)）分為大細胞為主型CTC（L-CTC）與小細胞為主型CTC（S-CTC）。其中大細胞為主型CTC 患者共52 例，小細胞CTC 為主型患者共56 例。見表1。

表1 2 組108 例CTC 患者的臨床病理資料

全組患者無圍術期死亡病例。截止隨訪終點，死亡38 例，全組OS 為64.8%，DFS 為54.6%；其中LCTC 組死亡15 例，中位生存期為29.3 個月，OS 為71.5%, DFS 為57.69%；S-CTC 組死亡23 例, 中位生存期為20.8 個月，OS 為58.92%；DFS 為51.78%，L-CTC 組OS 及DFS 高于S-CTC 組（＜0.05）（見圖1）以Cox 法單因素及多因素分析影響該組患者的預后因素，結(jié)果提示：TNM 分期、淋巴結(jié)累及以及小細胞型CTC 是影響本組患者預后的因素。見表2。

3 討論

表2 影響老年非小細胞肺癌預后的因素

近年來，肺癌是我國發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤。隨著發(fā)病率的上升，老年肺癌患者逐年增多，如何對這些耐受性較差的患者進行術前病情的精準評估、術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)，耐藥后早期干預，以提高治療效果，是目前亟需解決的問題。CTC 檢測因其無創(chuàng)性、可重復性已廣泛應用于肺癌的診療。然而檢索文獻，現(xiàn)階段的應用局限于單純計數(shù)，無法區(qū)分捕獲CTC 是否具有侵襲性，因此限制了該方法的臨床應用[6]。本研究在捕獲CTC 的基礎上，利用圖像分析系統(tǒng)，探索性的根據(jù)捕獲CTC 直徑大小，對捕獲CTC 進行分類，將CTC 分為大細胞CTC 和小細胞CTC，并結(jié)合臨床相關數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)小細胞型CTC在進展期疾病及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中較多，且與疾病的不良預后有關。通過本研究的開展，可判斷捕獲CTC 的侵襲性，部分解決腫瘤異質(zhì)性的特點。

循環(huán)腫瘤細胞通常是指從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶侵入人體外周血的腫瘤細胞。CTCs 一般以單細胞或者細胞團的形式存在于循環(huán)系統(tǒng)中。大部分侵入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞會在短期內(nèi)被機體免疫系統(tǒng)識別并清除，少數(shù)細胞通過腫瘤微環(huán)境的改變逃過免疫監(jiān)視，發(fā)展為具有侵襲性的CTCs，并相互聚集成團，進而形成CTC簇，并在一定條件下成為轉(zhuǎn)移灶[7]。因此在外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞常預示著將有可能發(fā)生腫瘤進展。國內(nèi)外多項研究報道，CTCs 可作為肺癌療效評價及預后、檢測轉(zhuǎn)移及復發(fā)的重要指標，也可檢測肺癌驅(qū)動基因的狀態(tài)，指導肺癌的靶向治療[8-10]。近年來雖然CTCs 檢測技術不斷發(fā)展，但由于富集和檢測方法不同，臨床上CTCs 的應用仍局限于簡單的計數(shù)，不能區(qū)分CTC 是否具活性，因此在指導臨床診療時可能會出現(xiàn)偏差；因此除了對CTCs 進行計數(shù)以外，如何在肺癌患者中篩選具有侵襲性的CTC，并在此基礎上分析及細胞表型及分子表型，是本研究的重點。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者中，小細胞型CTC 在發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移（15/18）及淋巴結(jié)累及的患者中較多（46/69），可見在老年患者中，小細胞型CTC 患者更容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。因此針對此類患者，術前出現(xiàn)小細胞型CTC，術中是否應行淋巴結(jié)采樣或系統(tǒng)性淋巴結(jié)清，術后是否需要加強治療仍需下階段的臨床研究證實。

目前認為，CTCs 從腫瘤的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶或者累及的淋巴結(jié)突破血管基底膜進入外周血，在此過程中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）或間充質(zhì)移動方式向阿米巴樣移動方式的轉(zhuǎn)變過程（MAT）[11]，絕大多數(shù)CTCs 在此階段被宿主免疫系統(tǒng)所清除，少部分細胞在逃脫免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸后，相互聚集成團，依附于外周血中的宿主細胞（主要白細胞、血小板），經(jīng)血流傳播至遠處器官（骨、腦、肺或肝等常見的肺癌轉(zhuǎn)移部位），經(jīng)種植生長發(fā)展為遠處轉(zhuǎn)移灶，由CTCs轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)移腫瘤細胞（disseminated tumor cells，DTCs）重復以上過程，將新的CTCs 釋放入血，形成新的遠處轉(zhuǎn)移灶[12]。在此過程中，CTCs 的形態(tài)學發(fā)揮重要的作用，Dong 等[13]的研究認為，小細胞型CTC 較大細胞型CTC，能更有效的逃脫免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸，從而形成遠處轉(zhuǎn)移灶。Loredana 等在乳腺癌裸鼠模型中發(fā)現(xiàn)，sCTC 更容易形成CTC 簇，且周圍有較多血小板粘附，能夠改變腫瘤微環(huán)境進行遠處轉(zhuǎn)移。但以上研究均未能從分子機制上進行探索，亦未能得出特異性的分子標志物。本研究嘗試將CTC 分型與臨床病理進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)CTC 分型與病理類型無關，只與疾病進展有關。這一現(xiàn)象提示，對于CTC形態(tài)學在肺癌中的應用，現(xiàn)階段仍應聚焦于動態(tài)監(jiān)測，以作為臨床診療證據(jù)的補充。在疾病發(fā)生進展時，是否存在CTC 形態(tài)學的轉(zhuǎn)換，CTC 形態(tài)學的改變能否作為藥物干預的依據(jù)，在老年肺癌患者中所獲得的CTC 形態(tài)學結(jié)論是否能推廣到所有患者中，這些都是后續(xù)工作中需要解決的問題。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CTC 形態(tài)學分析能夠較好的預測肺癌的預后及進展，小細胞型CTC 與肺癌的進展有關，且是老年NSCLC 預后的不良因素，但其影響肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機制，仍需進一步探索。