姜文容，繆應(yīng)新，王粟，丁立，王詩(shī)雯，趙虎，張艷梅

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040

肺癌是目前臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中90%以上的病理類型為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]。近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的突變已明確與NSCLC 的靶向治療藥物——EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的療效密切相關(guān)[2]。目前，臨床EGFR 突變檢測(cè)首選組織樣本[3]，但操作侵入性大、檢測(cè)耗時(shí)，無(wú)法均化腫瘤異質(zhì)性，尤其不適用于無(wú)法耐受侵入性取樣及發(fā)生獲得性耐藥后需二次活檢的老年患者。此時(shí)，循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸（circulating tumor deoxyribonucleic acid, ctDNA）可作為良好的替代檢測(cè)靶標(biāo)。ctDNA作為液體活檢的熱門(mén)標(biāo)志物之一，是存在于血漿等體液中的、來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的雙鏈DNA 片段，且攜帶高特異的腫瘤標(biāo)記，可用于患者全身腫瘤狀況變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[4-5]。近年來(lái)，血漿ctDNA EGFR 突變的檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于臨床NSCLC 患者EGFR-TKIs 靶向治療的療效評(píng)估，但其在老年NSCLC 患者中的突變狀況尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變狀況與患者性別、年齡、吸煙史、靶向藥物用藥史等臨床參數(shù)的相關(guān)性，旨在為老年患者的NSCLC 診療提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年6月—2020年3月，于復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院就診的老年NSCLC 患者84 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60 歲；（2）符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南（2019 版）》[6]，且組織病理學(xué)確診為NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其他器官或組織原發(fā)腫瘤；（2）近2 周內(nèi)曾接受放、化療治療；（3）伴有嚴(yán)重炎癥。通過(guò)患者信息登記表及查閱電子病歷收集患者的年齡、性別、吸煙史、靶向治療史和疾病狀態(tài)等臨床資料。84 例老年NSCLC 患者年齡60～90 歲，平均（71.4±8.6）歲，其中男性42 例、女性42 例；有吸煙史23 例、無(wú)吸煙史61 例；未接受靶向治療44例、接受一、二代EGFR-TKIs 靶向治療＞1 個(gè)月40例；病情穩(wěn)定32 例，腫瘤發(fā)生進(jìn)展52 例。研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（20160089）。

1.2 儀器與試劑NanoDrop One微量分光光度計(jì)和ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。核酸抽提試劑盒（AmoyDx離心柱型循環(huán)DNA 型核酸提取試劑）和EGFR 突變檢測(cè)試劑盒（AmoyDxEGFR 基因T790M 突變檢測(cè)試劑）購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 使用EDTA-K2采血管，采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血10 mL。每例樣本2 000 g 離心10 min分離所有血漿；8 000 g 再次離心10 min 后，分離4 mL血漿，采用AmoyDx循環(huán)DNA 型核酸提取試劑（離心柱型）進(jìn)行ctDNA 抽提。采用NanoDrop One 微量分光光度計(jì)檢測(cè)抽提樣本的ctDNA 濃度后，采用AmoyDxEGFR基因突變檢測(cè)試劑進(jìn)行EGFR突變的檢測(cè)。完成反應(yīng)混合液的配置及樣本和對(duì)照品的加樣后，使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)照品和各樣本內(nèi)控VIC 信號(hào)均判定合格的情況下，通過(guò)計(jì)算Ct 值（Ct 值= Ct 值FAM/ROX/CY5-Ct 值VIC）進(jìn)行結(jié)果判定，若Ct 值小于某型別判定下限則為該型別突變型，反之則為野生型。共可檢出7 類主要EGFR 突變類型，即：19del、L858R、T790M、20ins、G719X、L861Q 和S768I。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。患者年齡為正態(tài)分布計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；ctDNA 濃度為偏態(tài)分布計(jì)量資料，以中位數(shù)（四分位間距）表示，采用秩和檢驗(yàn)；EGFR 突變率及突變類型為計(jì)數(shù)資料，以例數(shù)表示，采用檢驗(yàn)，＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變率與老年NSCLC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性 84 例老年NSCLC 患者的血漿ctDNA 濃度為7.70（4.85,10.90）ng/L。不同年齡組的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.043），75～90 歲組患者血漿ctDNA 濃度較60～74 歲組更高。不同疾病狀態(tài)組的血漿ctDNA 濃度也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（=0.008），腫瘤進(jìn)展組患者的ctDNA 濃度高于病情穩(wěn)定組。

表1 老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度及EGFR 突變率與臨床各參數(shù)的相關(guān)性

46 例患者為EGFR 突變型，EGFR 突變率為54.76%。老年NSCLC 患者血漿ctDNA 的EGFR 突變率與靶向治療相關(guān)，未接受靶向治療組患者的突變率低于靶向治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.002）。其余各臨床參數(shù)分組的血漿ctDNA EGFR突變率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 血漿ctDNA EGFR 突變與老年NSCLC 患者臨床參數(shù)的相關(guān)性84 例老年NSCLC患者中，攜帶EGFRTKIs 敏感突變的有35 例，敏感突變率為41.67%；攜帶耐藥突變的有11 例，耐藥突變率為13.10%。75～90歲、無(wú)吸煙史的女性NSCLC 患者攜帶敏感突變的比例更高；而60～74 歲、有吸煙史的男性NSCLC 患者攜帶耐藥突變的比例更高。

在46 例突變型病例中，19 例檢出19del、14 例檢出L858R、10 例檢出T790M、3 例檢出其他EGFR突變型別。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，老年NSCLC 患者血漿ctDNA 的EGFR 突變與吸煙史（=0.046）、靶向治療史（=0.023）和疾病狀態(tài)（=0.016）均相關(guān)。接受靶向藥物治療組及疾病進(jìn)展組患者的T790M 檢出率高于未接受靶向治療組及疾病穩(wěn)定組。見(jiàn)表2。

3 討論

目前，肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。由于其發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期檢測(cè)手段，約80%患者確診時(shí)已屬中晚期，并可伴有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，致使其預(yù)后較差、生存率較低，已成為我國(guó)老年腫瘤患者主要的死亡原因[7]。

EGFR 是一種跨膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，其活性與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。EGFR 的突變與EGFR-TKIs 的療效密切相關(guān)。在亞裔NSCLC 患者中，EGFR 的突變率高達(dá)50%[9]，其中19 號(hào)外顯子的缺失突變以及21 號(hào)外顯子的L858R突變約占EGFR 突變總數(shù)的90%，與患者對(duì)EGFR-TKIs治療的敏感性顯著關(guān)聯(lián)[10]。EGFR 20 號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變T790M 是最主要的EGFR-TKIs 治療后獲得性耐藥突變[11]。通常接受一、二代EGFR-TKIs 治療的患者會(huì)在治療后的9～13 個(gè)月出現(xiàn)耐藥，其中約50%的患者是由于T790M 突變所致[12]。

目前，組織活檢是EGFR 檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其侵入性大、無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、且檢測(cè)結(jié)果受樣本采集影響大。而血漿ctDNA 的EGFR 突變檢測(cè)僅需采集患者血液樣本，創(chuàng)傷??；可實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)采樣，實(shí)時(shí)跟蹤疾病的進(jìn)展，尤其是發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性耐藥；還能夠克服腫瘤組織異質(zhì)性的影響，尤其適用于無(wú)法通過(guò)再次手術(shù)或活檢獲取腫瘤組織的患者，已被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤患者的輔助診斷[13-14]。ctDNA 的基因特性與原位腫瘤組織高度一致[15]，監(jiān)測(cè)ctDNA 的EGFR 突變負(fù)荷變化能夠在影像學(xué)變化前對(duì)患者進(jìn)行療效評(píng)估[16]，故血漿ctDNA EGFR 突變狀況的連續(xù)監(jiān)測(cè)在NSCLC 患者接受EGFR-TKIs 靶向治療療效評(píng)估方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，血液中的ctDNA 含量極少，因而對(duì)其檢測(cè)方法的靈敏度要求也更高。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡組和不同疾病狀態(tài)組的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高年齡組的ctDNA 濃度高于低年齡組，其可能的原因?yàn)楦吣挲g組患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷隨著病程延長(zhǎng)而逐步增加，導(dǎo)致ctDNA 釋放增多。進(jìn)展組的ctDNA 濃度高于穩(wěn)定組，則可能是由于ctDNA 濃度與腫瘤的活動(dòng)性相關(guān)，在腫瘤進(jìn)展期ctDNA 的釋放可增加[17]。通過(guò)對(duì)血漿ctDNA 的EGFR 突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，老年NSCLC 患者的EGFR 突變率為54.76%，略高于亞裔人群的普遍突變率（約50%）[9]，說(shuō)明基于血漿ctDNA的EGFR 突變檢測(cè)同樣能為臨床EGFR-TKIs 的使用提供參考依據(jù)。同時(shí)，研究結(jié)果顯示老年NSCLC 患者的EGFR 突變率與其靶向治療史有關(guān)，接受靶向治療組患者的EGFR 突變率高于未接受靶向治療組?？紤]其可能的原因?yàn)椋海?）未接受靶向治療的患者通常是由于基礎(chǔ)疾病等原因無(wú)法進(jìn)行組織樣本檢測(cè)的群體，其EGFR 突變狀況未知，突變率符合人群一般水平；（2）而接受靶向治療的患者通常以確認(rèn)EGFR 突變狀況的改變和是否需要更換治療手段為檢測(cè)目的，多數(shù)已通過(guò)先期檢測(cè)確定攜帶有EGFR-TKIs 敏感突變，在進(jìn)行靶向治療后、疾病發(fā)生進(jìn)展時(shí)進(jìn)行復(fù)檢以確認(rèn)是否出現(xiàn)獲得性耐藥突變，通常至少攜帶1 種突變，甚至可檢出雙重突變；（3）此外，化療可導(dǎo)致EGFR 突變狀況的改變[18]，故聯(lián)合使用化療的患者也需定期復(fù)檢以保證靶向療效。進(jìn)一步對(duì)EGFR 突變狀況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，接受靶向治療組和疾病進(jìn)展組的T790M 檢出率高于未接受靶向治療組和疾病穩(wěn)定組，與以往的研究結(jié)果一致[19]，也再次證實(shí)了T790M 為EGFRTKIs 最重要的獲得性耐藥突變位點(diǎn)，以及在靶向治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)EGFR 突變的重要性。本次研究還發(fā)現(xiàn)老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變類型與吸煙史有關(guān)，與既往報(bào)道不一致[20]，其原因可能與入組患者數(shù)量和檢測(cè)方法等因素有關(guān)。

表2 老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變與臨床各參數(shù)的相關(guān)性

本研究綜合分析了老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變狀況與各臨床參數(shù)間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)不同年齡、疾病狀態(tài)的老年NSCLC 患者血漿ctDNA 濃度存在差異；老年NSCLC 患者血漿ctDNA EGFR 突變率相對(duì)較高，并與靶向治療史相關(guān)，且EGFR 突變狀況也因靶向治療史和疾病狀態(tài)的不同而存在差異，證實(shí)了血漿ctDNA EGFR 突變檢測(cè)在臨床EGFR-TKIs治療和療效評(píng)估中的重要性。本研究也存在一定局限性，如病例數(shù)有限、未對(duì)患者進(jìn)行靶向治療前后的跟蹤分析，尚無(wú)法全面評(píng)估血漿ctDNA EGFR 突變檢測(cè)在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，有待在未來(lái)工作中進(jìn)一步完善。綜上所述，血漿ctDNA EGFR 突變檢測(cè)具有實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)和均質(zhì)等優(yōu)勢(shì)，在臨床實(shí)際診療中，應(yīng)盡量獲取患者全身腫瘤狀況的動(dòng)態(tài)變化，并結(jié)合具體臨床參數(shù)，為臨床老年NSCLC 患者提供更精準(zhǔn)的診療服務(wù)。