陳正謙，周崇治

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海200080

人口老齡化進(jìn)程加劇是中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率上升的重要原因之一。胃癌與年齡有密切關(guān)系，老年人群發(fā)病率較高[1-2]。胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)老年患者基礎(chǔ)疾病多且確診時(shí)多處于臨床中晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]?；熓俏赴┑闹匾委熓侄沃?，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）為基礎(chǔ)的輔助化療，能有效改善老年胃癌患者的預(yù)后，然而化療耐藥性制約了化療療效[4-5]。因此，探討胃癌化療耐藥的相關(guān)機(jī)制有助于為老年胃癌患者的化療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液（中國(guó)江蘇新賽美公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；過(guò)表達(dá)、敲減慢病毒及陰性對(duì)照（中國(guó)上海吉滿公司）；抗體（英國(guó)Abcam 公司）；Tubulin 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；EdU 檢測(cè)試劑盒（中國(guó)廣東銳博公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒（中國(guó)浙江聯(lián)科生物公司）；Trizol（日本Takara 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix（中國(guó)上海翊圣公司）。

1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek 公司)；DMI6000B 熒光顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)；Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）。

1.3 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS、MKN28、SGC7901和MKN45 均由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室保存。所有細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

實(shí)驗(yàn)分為AGS 空白對(duì)照組（AGS-CON）、AGS陰性對(duì)照組（AGS-Vector）、AGS 過(guò)表達(dá)組（AGS-HOXA13）；MKN28 空白對(duì)照組（MKN28-CON）、MKN28 陰性對(duì)照組（MKN28-Vector）、MKN28 過(guò)表達(dá)組（MKN28-HOXA13）；SGC7901 空白對(duì)照組（SGC7901-CON）、SGC7901 陰性對(duì)照組（SGC7901-Scramble）、SGC7901 敲減組（SGC7901-sh-HOXA13）；MKN45 空白對(duì)照組（MKN45-CON）、MKN45 陰性對(duì)照組（MKN45-Scramble）、MKN45敲減組（MKN45-sh-HOXA13），其中AGSHOXA13、MKN28-HOXA13、SGC7901-sh-HOXA13和MKN45-sh-HOXA13 為實(shí)驗(yàn)組。

1.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，使用BCA 試劑盒測(cè)定濃度。通過(guò)10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。脫脂牛奶室溫封閉1.5 h 后，（1∶1 000）、Tubulin（1∶1 000）一抗4℃孵育過(guò)夜。次日二抗室溫孵育1 h 后，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn) 胃癌細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入不同濃度梯度（1.25M、2.5M、5M、10M、20M）的5-FU，或加入等體積的PBS。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的CCK-8 試劑，37℃孵育2 h 后，測(cè)定450 nm 處的吸光度。通過(guò)吸光度計(jì)算各濃度5-FU 對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率，運(yùn)用Logit 法計(jì)算各株胃癌細(xì)胞5-FU 的IC25和IC50。

1.7 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 胃癌細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接種于96孔板內(nèi)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入5-FU（AGS：6M、MKN28：6M、SGC7901：12M、MKN45：3M）或等體積的PBS。分別在0、24、48和72 h 加入經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的CCK-8 試劑，37℃孵育2 h 后，測(cè)定450 nm 處的吸光度并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.8 EdU 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 胃癌細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）接種于96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5-FU（AGS：6M、MKN28：6M、SGC7901：12M、MKN45：3M）。培養(yǎng)48 h 后，加入經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的EdU 溶液。37℃孵育2 h 后，按照EdU 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞固定和染色，通過(guò)熒光顯微鏡統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)并計(jì)算EdU 陽(yáng)性率。

1.9 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將胃癌細(xì)胞（5×105個(gè)/孔）接種于6 孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5-FU（SGC7901：12M、MKN45：3M）或等體積的PBS。培養(yǎng)48 h 后，用500L 結(jié)合緩沖液收集細(xì)胞懸液。按照Annexin V-PE/7-AAD 凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.10 二代測(cè)序分析 提取經(jīng)5-FU 處理的AGS-HOXA13細(xì)胞和AGS-Vector 細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建后，使用Agilent 2200 檢測(cè)儀檢測(cè)。具體分析步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]，二代測(cè)序技術(shù)由上海烈冰科技公司提供支持。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，使用SYBR Green Master Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（變性95℃、退火60℃、延伸60℃，循環(huán)40 次）。以作為內(nèi)參，檢測(cè)的mRNA 表達(dá)情況。及引物合成由中國(guó)上海生工生物公司完成。見(jiàn)表1。

表1 GAPDH和ABCC4引物序列

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)，＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表2 藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞5-FU 的IC25 和IC50 值（M）

3 討論

CCK-8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中，表達(dá)水平低下組的胃癌細(xì)胞經(jīng)5-FU 處理后，生長(zhǎng)速度最為緩慢。通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照+5-FU 組相比，敲減+5-FU組的EdU 陽(yáng)性率降低，提示低表達(dá)狀態(tài)下，胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU 較為敏感。抵抗化療藥物誘導(dǎo)凋亡是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要原因之一[14]。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)后，5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901、MKN45 的凋亡誘導(dǎo)作用增強(qiáng)。提示表達(dá)抑制后會(huì)增強(qiáng)5-FU 的抗增殖作用，促進(jìn)5-FU 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性。