楊翠萍 ，楊曉金，楊燕萍，張夢茵，謝 玲，俞驍珺，蔡波爾，陳登宇，陳 平，吳云林

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院消化科，上海 201801；2.江西省九江市第一人民醫(yī)院感染控制科，江西 九江 332000；3.江西省九江市婦幼保健醫(yī)院檢驗科，江西 九江 332000；4 .安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，安徽 蚌埠 233030）

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢，腫瘤的復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致治療失敗[1]。據(jù)統(tǒng)計，2014 年全國新確診的胃癌病例數(shù)達410 例，約占全部癌癥發(fā)病的11%，發(fā)病率為30.00/10 萬[2]，現(xiàn)已位居我國高發(fā)且死亡率高的惡性腫瘤前三位。近年來，胃癌的新發(fā)患者呈年輕化趨勢，因此對于胃癌的防治，勢在必行。胃癌的防治關(guān)鍵在于“早”，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，故而尋找胃癌早期檢測靶點至關(guān)重要。

研究表明，微小RNA（microRNA,miRNA,miR）可調(diào)節(jié)細胞染色體基因DNA 的轉(zhuǎn)錄表達[3]，在胃癌細胞的生長增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。研究表明，miR-200 家族與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，對腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT） 相關(guān)基因鋅指E 盒增強子結(jié)合蛋白（zinc finger E-box enhancer binding protein,ZEB）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用[4]。研究提示，miR-200家族與其靶基因ZEB2、ZEB1 構(gòu)成雙向負反饋環(huán)，調(diào)節(jié)與腫瘤細胞移動、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的EMT 進程，可作為基因治療的分子靶點用于臨床診療[5]。針對miR-200 家族的研究將有助于選擇有效的分子調(diào)控靶點對腫瘤進行治療。EMT 標志物之一波形蛋白（vimentin）的表達增加與腫瘤侵襲相關(guān)，可促進細胞的運動，為預(yù)測腫瘤細胞的分化程度及患者預(yù)后提供依據(jù)。在其他腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤等的EMT 相關(guān)研究中，已有波形蛋白與疾病的進展及預(yù)后相關(guān)的報道，但其在胃癌中的研究則相對匱乏。本研究擬檢測人胃癌細胞BCG823 細胞系中miR-200c 的靶點，觀察其對細胞功能的影響，并檢測相關(guān)分子波形蛋白基因的表達情況。

材料與方法

一、材料

人胃癌細胞株BGC823 細胞購自中科院上海細胞所，Transwell TM 小室購自Corning Costar 公司，RNA 提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司，實時定量PCR 試劑、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑盒及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自上海生工生物有限公司，G418 購自Sigma 公司，基質(zhì)膠購自BD 公司，兔抗人ZEB2 抗體、兔抗人GAPDH 抗體購自Cell Signaling Technology 公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen 公司。

二、方法

1.實時定量聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）檢測人胃癌BGC823 細胞中ZEB2 表達情況：引物設(shè)計參照相關(guān)文獻及GenBank 中人ZE B2、β-actin 序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件，于基因不同外顯子上設(shè)計正反義引物，引物序列及產(chǎn)物大小如下。ZEB2上游引物為5'-CCTCCCGACACTCT TGGCGA-3'，下游引物為5'-GGGCGAGTGGGCTTCCT-3'，產(chǎn)物大小為160 bp；β-actin 上游引物為5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物為5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，產(chǎn)物大小為234 bp。將培養(yǎng)的人胃癌BGC823 細胞抽提總RNA，行反轉(zhuǎn)錄PCR或定量PCR 擴增ZEB2，以β-actin 作為內(nèi)參。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定及轉(zhuǎn)染：參照文獻[6]進行干擾質(zhì)粒構(gòu)建，ZEB2 的cDNA 序列見GenBank NM001171653.2，ZEB2 siRNA（#16704）購自Ambion（美國）。以干擾質(zhì)粒pSUPER-EGFP1 為載體，針對ZEB2 基因構(gòu)建干擾重組質(zhì)粒shZEB2，后經(jīng)基因測序驗證構(gòu)建成功。重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細胞后，用有限稀釋法及G418 耐藥篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。同時構(gòu)建陰性對照干擾質(zhì)粒pSUPEREGFP1-Scramble shRNA（簡稱Scramble 重組質(zhì)粒）。

3.蛋白印跡法檢測ZEB2 蛋白和波形蛋白的表達： 分別收獲野生型BGC823 細胞及轉(zhuǎn)染shZEB2、Scramble 重組質(zhì)粒的胃癌BGC823 細胞各5×105個，裂解細胞，離心后取上層清液，獲得細胞裂解蛋白；測定蛋白濃度，采用蛋白印跡法檢測蛋白表達水平。在110 V 恒壓電流下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上2 h，用5%牛奶封閉1 h；分別加入兔抗人ZEB2 抗體（1∶1 000）、波形蛋白抗體（1∶1 000）兔抗人GAPDH 抗體（1∶2 000），4 ℃下孵育過夜；洗滌3 次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h；洗滌3 次，用電化學(xué)發(fā)光法檢測ZEB2 蛋白表達情況。

4.MTT 法檢測BGC823 細胞增殖能力：參照文獻[6]將轉(zhuǎn)染shZEB2、Scramble 重組質(zhì)粒的BGC823細胞分為shZEB2 實驗組和Scramble 對照組進行實驗。分別將不同轉(zhuǎn)染細胞用含血清培養(yǎng)液配制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后按照每孔10 000 個細胞接種于96 孔板，設(shè)立空白組。培養(yǎng)6 d，每天每組細胞各取6 孔，每孔加入0.5 g/L MTT 溶液；37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上層清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，輕輕振蕩以充分溶解結(jié)晶物。用酶聯(lián)免疫吸附檢測儀在波長490 nm 處測定各孔的吸光度（absorbance，A）值，以時間為橫軸，A 值為縱軸繪制生長曲線。

5.Transwell 侵襲實驗檢測腫瘤細胞BGC823細胞侵襲力： 將轉(zhuǎn)染的BGC823 細胞分為shZEB2實驗組和Scramble 對照組進行實驗。采用Transwell TM 小室基質(zhì)膠（Matrigel）侵襲實驗測定腫瘤細胞的侵襲力。參考文獻[7]的方法，按照8∶1 的比例將無血清培養(yǎng)基與基質(zhì)膠Matrigel 混合，放Transwell TM 小室于24 孔板內(nèi)，將稀釋好的Matrigel 150 μL 置于Transwell TM 上層。37 ℃處理1 h，待Matrigel 凝固后，每孔加無血清培養(yǎng)基300 μL，每孔種細胞2×104個；小室下層加含血清完全培養(yǎng)基600 μL 后，放在細胞培養(yǎng)箱中孵育。24 h 后分別取出小室，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS） 清洗3 次，用棉簽刮除濾膜上的細胞，膜下面的細胞用甲醇固定；采用10 g/L 結(jié)晶紫染色15 min，用PBS 洗3 次；晾干后在倒置顯微鏡高倍鏡下觀察并拍照，同時用Image J 軟件計數(shù)細胞。

6.劃痕試驗檢測BGC823 細胞的遷移能力：將轉(zhuǎn)染的BGC823 細胞分為shZEB2 實驗組和Scramble 對照組進行實驗。參考文獻[7]的方法，將待觀測細胞種于6 孔板中，待生長匯合成片后進行檢測。更換成含50 mL/L 小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，用無菌中號槍頭在孔內(nèi)劃線，使劃線處無細胞生長；在0 h、24 h 和48 h 時，分別在倒置顯微鏡相同位置下觀察劃痕、無細胞處的寬度，并拍照記錄。采用公式愈合度=（原始劃痕寬度-某時點劃痕寬度）/原始劃痕寬度×100%進行分析計算，判定細胞遷移能力。實驗重復(fù)3 次。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，用表示計量資料，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆篩選

以含1 000 μg/mL 的G418、10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基初步篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞，隨后在熒光顯微鏡下找出表達綠色熒光蛋白的陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆，以有限稀釋法篩選得到陽性單個細胞克隆，隨后培養(yǎng)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。

二、轉(zhuǎn)染后BCG823 細胞中ZEB2 蛋白表達

篩選得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，提取總蛋白經(jīng)蛋白印跡法檢測ZEB2 蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與野生型BCG823 細胞相比，轉(zhuǎn)染了pSUPER-EGFP1-Scramble 質(zhì)粒的BCG823 細胞ZEB2 蛋白表達與野生型基本相同，而轉(zhuǎn)染shZEB2 質(zhì)粒組細胞的ZEB2蛋白表達顯著下降（見圖1A）。實時定量PCR 結(jié)果亦顯示，轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中ZEB2 mRNA 表達亦明顯下 降 （見圖1B），提示 轉(zhuǎn)染shZEB2 質(zhì)量后BCG823 細胞中ZEB2 蛋白表達明顯降低，可用于后續(xù)功能性實驗研究ZEB2 低表達時胃癌細胞BCG823 生物學(xué)性狀的改變。

圖1 轉(zhuǎn)染后BCG823 細胞中ZEB2 表達

三、轉(zhuǎn)染后胃癌細胞BCG823 增殖力檢測

用MTT 實驗檢測轉(zhuǎn)染后胃癌細胞增殖能力，結(jié)果顯示，自第4 天開始，shZEB2 組較Scramble 組BCG823 細胞中腫瘤細胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。該結(jié)果顯示，ZEB2 低表達時胃癌細胞增殖能力降低（見圖2）。

表1 不同時間細胞的增殖能力（個）

圖2 MTT 實驗檢測轉(zhuǎn)染腫瘤細胞增殖力

四、腫瘤細胞侵襲力檢測

本研究采用Transwell 小室法檢測腫瘤細胞侵襲能力，將腫瘤細胞種于Transwell 小室內(nèi)24 h后，取出小室，采用結(jié)晶紫染色小室背面的基質(zhì)膠，在高倍顯微鏡下觀察小室背面基質(zhì)膠里的細胞，了解腫瘤細胞侵襲情況。結(jié)果顯示，shZEB2 組較Scramble 組的胃癌細胞侵襲力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果提示，ZEB2 低表達時胃癌細胞在基質(zhì)膠中的侵襲能力降低（見圖3）。

圖3 Transwell 小室基質(zhì)膠腫瘤細胞侵襲實驗

五、細胞遷移能力檢測

0 h、24 h、48 h 時，分別在顯微鏡相同位置下觀察劃痕無細胞處豎線寬度，比較各時間劃痕無細胞區(qū)域?qū)挾?，判斷愈合度。由圖4 可見，shZEB2 組較Scramble 組的胃癌細胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示ZEB2 低表達時胃癌細胞遷移能力降低。

六、波形蛋白mRNA 檢測

用實時定量PCR 檢測波形蛋白mRNA 的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shZEB2 組較Scramble 對照組胃癌BCG823 細胞中波形蛋白mRNA 表達量下降（P＜0.05），蛋白印跡法檢測也得到了同樣的結(jié)果。而波形蛋白表達量下降提示引起胃癌細胞侵襲能力減弱（見圖5）。

圖4 細胞遷移能力檢測

圖5 轉(zhuǎn)染后BCG823 細胞中波形蛋白及其mRNA 表達

討 論

EMT 是細胞發(fā)生分子轉(zhuǎn)換，因細胞失去上皮特性而獲得間質(zhì)特性，繼而具備運動性以掙脫細胞間黏附，并侵犯其他部位的過程。EMT 中上皮細胞即可獲得間質(zhì)樣特性，表達EMT 標志物——促進細胞運動的波形蛋白增高等，亦可表達干細胞的標志物，也可形成干細胞樣細胞[5]。胃癌細胞發(fā)生EMT可使腫瘤細胞獲得間質(zhì)化表型移動性增強，發(fā)生向外的擴散性運動，導(dǎo)致腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，從而促進病情惡化，減短患者生存期。

一、miR-200 和ZEB 家族反饋調(diào)控

在病理條件下，各種EMT 程序的異常激活會導(dǎo)致纖維化和癌癥轉(zhuǎn)移。幾種作用于EMT 通路下游的多效性激活轉(zhuǎn)錄因子被歸類為EMT 的主調(diào)控因子，包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子的SNAIL（SNAI1 和SNAI2）和ZEB（ZEB1 和ZEB2）家族。研究證實，ZEB 蛋白與多種miRNA 之間存在重要的調(diào)控關(guān)系。miRNA 是一種小的非編碼RNA，可與相應(yīng)mRNA 中的30 非翻譯區(qū)UTR 結(jié)合而使同源靶基因沉默，從而抑制翻譯或mRNA 降解。

高度參與EMT 調(diào)控的miRNA 是miR-200 家族，其由5 個成員組成，形成2 個簇。miR-200b、miR-200a 和miR-429 在人類1 號染色體上聚集，而miR-200c 和miR-141 在12 號染色體上聚集，每個聚類表達為一個多順時針轉(zhuǎn)錄本。在miR-200 家族中，結(jié)合特異性不同，miR-200a-141（subgroup Ⅰ）和miR-200b-200c-429（subgroup Ⅱ）的種子序列不同。在最初的研究中，miR-200c 與ZEB125、miR-200b與ZEB226 在培養(yǎng)的癌細胞中呈負相關(guān)關(guān)系。miR-200 家族對ZEB1 和ZEB2 的抑制導(dǎo)致關(guān)鍵上皮標志物E-cadherin 表達增強，并獲得上皮表型[8-9]。此外，對NCL-60 細胞株的分析提示，miR-200 家族的表達被建立為上皮表型的標志物。隨后一系列與EMT 相關(guān)的體外模型系統(tǒng)研究對24 個miRNA-200 家族成員進行了探索，在用轉(zhuǎn)化生長因子β 或酪氨酸磷酸酶Pez 異位表達的MDCK 細胞誘導(dǎo)EMT 時，miR-200 家族和E-鈣粘連蛋白被抑制，同時ZEB1 和ZEB2 表達增加。轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)EMT的能力依賴于miR-200 家族的抑制和ZEB1、ZEB2表達水平。相反，miR-200 家族在原本是間充質(zhì)細胞中的表達，可以誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果證實了，miR-200 家族通過上皮表型的建立和維持來抑制ZEB1 和ZEB2 的表達，從而抑制EMT 的進展。

miRNA-200 家族對ZEB 表達的抑制是直接的，其發(fā)生是由于miRNA 結(jié)合到ZEB1 和ZEB2 mRNA 30 非翻譯區(qū)盒子中的8 和9 這2 個位點[10-12]。已有研究在乳腺癌和結(jié)腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了一個額外的miR200-ZEB 蛋白調(diào)控位點，其中ZEB1被shRNA 下調(diào)。細胞發(fā)生間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化后，miR-200 家族相應(yīng)上調(diào)，最顯著的是miR-141/200c 轉(zhuǎn)錄本。miR-141/200c 啟動子包含多個高度保守的E-盒子，這些E-盒子在間充質(zhì)細胞中被ZEB1 占據(jù)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。數(shù)據(jù)顯示，ZEB1 缺失的細胞保留了上皮表型miR200 抑制，其建立了一個反饋回路，miR-200 與ZEB1 相互負控制對方的表達[13-14]。這一調(diào)控環(huán)的存在得到了證實，并進一步擴展到包括miR-200 家族的其他成員[15]。數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)上皮細胞表達高水平的miR-200 家族，可直接抑制ZEB1 和ZEB2，從而使上皮鈣黏素表達。然而，如果細胞外信號刺激了ZEB1 的表達，則miR-200 家族被抑制，EMT 得以繼續(xù)進行。

miR-200-ZEB 循環(huán)與EMT 間的相關(guān)性已在體內(nèi)得到證實。在p53-/Kras（G12D）肺腺癌模型中，miR-200 家族在轉(zhuǎn)移易感性腫瘤和轉(zhuǎn)移無能性腫瘤中差異表達最為顯著。此外，在易轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中，miR-200b 的高表達破壞了其在同基因小鼠中進行EMT 和轉(zhuǎn)移的能力。同樣，在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤小鼠模型中，miR-200 家族成員的低表達是基因表達特征的一部分[16]。然而在臨床樣本中，miR-200a 和miR-200b 水平的升高及ZEB2 啟動子的高甲基化，與不同形式的人類胰腺癌及慢性胰腺炎有關(guān)。最近一項乳腺癌研究顯示，miR-200/ZEB循環(huán)在腫瘤進展中具有雙重作用[17]。與胰腺癌標本一樣，miR-200 家族成員在乳腺癌標本中的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移、定植呈正相關(guān)，且在轉(zhuǎn)移擴散率較高的細胞中表達升高。在原位乳腺癌模型中，建立肺轉(zhuǎn)移模型需要增強這些miRNA 的表達。這與miR-200 家族成員的表達形成對比，miR-200 家族成員在體外降低腫瘤細胞的侵襲能力，在體內(nèi)減少了腫瘤細胞在血液中的循環(huán)數(shù)量，表明miR-200 家族在癌癥中扮演著一種新的雙面的角色，一方面可阻止腫瘤細胞進入循環(huán)，另一方面又促進了腫瘤細胞在遠處器官的定植[17]。

二、miR-200c 可抑制惡性腫瘤生長

研究表明，miR-200c 對不同腫瘤系有抑制作用。在多種惡性腫瘤如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等中，ZEB1 和ZEB2 與miR-200 家族構(gòu)成雙向反饋環(huán)調(diào)節(jié)上皮性腫瘤的EMT 能力[4,18-19]；降低miR-200c水平可提高Bmi-1 水平，從而促進黑色素瘤細胞的生長以及產(chǎn)生化療抵抗性[20]。同時，降低的miR-200c意味著上皮性卵巢癌預(yù)后不良，因為miR-200c 可抑制上皮性腫瘤的EMT 轉(zhuǎn)化能力，多種上皮性惡性腫瘤中miR-200c 減少，預(yù)示腫瘤多侵襲、轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。此外，miR-200c 還可通過其他多種靶點抑制腫瘤細胞的生長、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移。miR-200c 對腫瘤細胞EMT 能力的抑制作用比較明確，但具體下游機制仍不完全清楚，有待深入研究。

上皮性惡性腫瘤中，腫瘤組織中的miR-200c表達水平較癌旁組織下降，在轉(zhuǎn)移性癌細胞中更為明顯，這與腫瘤細胞間質(zhì)化表型的維持有關(guān)，miR-200c 表達下降導(dǎo)致了癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及放化療抗性增加[21-23]。誠然，尚有其他多種因素影響和調(diào)控著胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及放化療抗性[24-28]。

三、ZEB2 基因表達降低而miR-200c 升高條件下BCG823 胃癌細胞生長受抑制

本研究結(jié)果顯示，降低人胃癌細胞株BCG823內(nèi)ZEB2 基因的表達，miR-200c 表達升高，波形蛋白基因表達降低，胃癌細胞的遷移、侵襲及增殖能力均降低?？梢姡琙EB2 是miR-200c 的一個重要靶點，以期miR-200c 及其靶點ZEB2 用于胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移控制的分子靶向治療，為胃癌的科學(xué)防治提供新策略，有關(guān)其具體機制尚待進一步深入研究。