劉 政，胡孫田，沈曉飛，朱 培，褚旭東，李卓婭，羅 平

（1. 長(zhǎng)興縣林業(yè)局，浙江 長(zhǎng)興 313100；2. 長(zhǎng)興縣林場(chǎng)，浙江 長(zhǎng)興 313100；3. 浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；4. 浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量施用化肥，人為地增加了土壤的含鹽量，使園藝作物受到鹽害，導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)下降。因此，可通過(guò)改良土壤，或者提高植物耐鹽性來(lái)解決產(chǎn)品質(zhì)量下降的問題。鹽脅迫可以引發(fā)植物體內(nèi)鹽分的過(guò)度積累，導(dǎo)致植物產(chǎn)生離子毒害、膜系統(tǒng)氧化損傷、滲透調(diào)節(jié)失衡，輕者影響花卉的品質(zhì)，重者直接導(dǎo)致植株死亡[1]。月季Rosa chinensis不僅是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，也是重要的切花材料，具有極高的市場(chǎng)價(jià)值[2]。但在月季栽培過(guò)程中，鹽脅迫往往會(huì)降低月季開花期、開花量，降低花香、花色等品質(zhì)，導(dǎo)致月季不具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。褪黑素(melatonin, MT)屬于吲哚雜環(huán)類化合物，其化學(xué)名是N-乙?；?5甲氧基色胺，具有清除活性氧、自由基，維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低過(guò)氧化物含量的功能[3]。最近研究表明：外源褪黑素處理可以有效減輕鹽脅迫對(duì)平邑甜茶Malus hupehensis的氧化脅迫傷害，增強(qiáng)蘋果Malus domestica砧木的抗鹽能力[4]；同時(shí)外源褪黑素處理也可以提高番茄Solanum lycopersicum鹽分脅迫下的果實(shí)品質(zhì)[5]和緩解鹽分對(duì)獼猴桃Actinidia chinensis幼苗的傷害[6]；對(duì)切花月季保鮮也具有積極的作用[7]。但到目前為止，關(guān)于外源褪黑素處理對(duì)月季鹽脅迫下生理特性還缺乏深入研究。本研究以中國(guó)古老月季‘月月粉’Rosa chinensis‘Old Blush’為材料，采用根灌褪黑素的方法，分析測(cè)定鹽脅迫下月季幼苗葉片生理指標(biāo)的變化，探討褪黑素影響月季苗鹽脅迫響應(yīng)的生理機(jī)制，為合理利用褪黑素，解決月季栽培中的鹽害問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以中國(guó)古老月季‘月月粉’90 d 扦插苗為材料，栽培基質(zhì)為V(泥炭)∶V(椰殼)∶V(珍珠巖)=1∶1∶1，置于人工氣候箱培養(yǎng)，光照時(shí)間為 16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)溫度為(23±2) ℃。研究共分5組，其中3組分別連續(xù) 5 d 在 8:00 對(duì)根部澆灌 50 mL 濃度分別為 0、5、10 和 20 μmol·L?1的褪黑素溶液，其余 2 組以清水為對(duì)照。在最后1次澆灌褪黑素溶液后的第2天開始鹽脅迫處理。任選1組澆灌清水的植株作為空白對(duì)照(ck)，即繼續(xù)澆灌清水，其余4組植株均每隔5 d澆灌50 mL濃度分別為200 mmol·L?1的氯化鈉，連續(xù)澆灌 20 d。5 個(gè)處理分別為清水 (ck)、200 mmol·L?1氯化鈉 (T)、5 μmol·L?1褪黑素+200 mmol·L?1氯化鈉 (S1)、10 μmol·L?1褪黑素+200 mmol·L?1氯化鈉 (S2)和 20 μmol·L?1褪黑素+200 mmol·L?1氯化鈉(S3)，各處理6盆，重復(fù)3次。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定，丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)采用BCA法測(cè)定，抗壞血酸采用分光光度計(jì)法測(cè)定[8]，相對(duì)電導(dǎo)率采用DDB-303A型電導(dǎo)率儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下月季葉片膜脂過(guò)氧化的影響

相對(duì)電導(dǎo)率是衡量植物細(xì)胞膜通透性的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖1A可知：在鹽脅迫下，月季苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高，其中200 mmol·L?1氯化鈉(T)處理的相對(duì)電導(dǎo)率最高，達(dá)45.34%；不同濃度外源褪黑素處理下，月季葉片的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于T處理(P＜0.05)，特別是10 μmol·L?1褪黑素(S2)處理下，相對(duì)電導(dǎo)率最低，為33.58%(圖1A)。表明外源褪黑素處理可以顯著抑制鹽脅迫條件下月季苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率的升高，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，其中10 μmol·L?1褪黑素處理抑制效果最明顯。丙二醛質(zhì)量摩爾濃度作為脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱，細(xì)胞受損越嚴(yán)重，其含量越高。由圖1B可知：在鹽脅迫下，月季苗葉片的丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，其中T處理最高(P＜0.05)，為13.37 nmol·g?1；然而不同濃度外源褪黑素處理下，月季苗葉片的MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著低于T處理(P＜0.05)，特別是10 μmol·L?1褪黑素(S2)處理下，MDA質(zhì)量摩爾濃度最低，為9.50 nmol·g?1。表明褪黑素處理可有效抑制鹽脅迫下月季葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的增加，從而緩解膜脂質(zhì)的過(guò)氧化。

圖 1 不同處理下月季苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率(A)和丙二醛(B)的變化Figure 1 Change of conductivity(A) and MDA(B) of rose leaves under different treatments

2.2 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下月季滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

抗壞血酸(AsA)是植物體內(nèi)重要的非酶促抗氧化劑，在清除植物體內(nèi)活性氧和緩解膜脂過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞的損傷方面具有積極的作用。由圖2A可知：在鹽脅迫下月季苗葉片AsA質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，為0.99 mg·g?1；不同濃度外源褪黑素處理下，其AsA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于ck和T處理(P＜0.05)，特別是10 μmol·L?1褪黑素 (S2)處理下，其 AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.60 mg·g?1。表明外源褪黑素處理能顯著增加月季苗鹽脅迫過(guò)程中的AsA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而提高植株的抗鹽脅迫能力。鹽脅迫下月季苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于ck(P＜0.05)，其中T處理的可溶性蛋白質(zhì)最低，為4.57 mg·g?1(圖2B)；而外源褪黑素處理，可以顯著減少月季苗葉片可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低，特別是20 μmol·L?1褪黑素處理下，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.33 mg·g?1。鹽脅迫下，隨褪黑素濃度的增加，月季苗葉片脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加。當(dāng)褪黑素濃度為 20 μmol·L?1時(shí)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為 23.20 μg·g?1(圖 2C)。表明外源褪黑素處理可以顯著增加鹽脅迫下月季葉片中抗壞血酸、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖 2 不同處理下月季葉片抗壞血酸 (A)、可溶性蛋白質(zhì) (B) 和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) (C) 的變化Figure 2 Change of ascorbic acid(A), soluble protein content(B) and proline content(C) of rose leaves under different treatments

2.3 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下月季抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)作為植物逆境條件下重要的防御體系，可有效清除細(xì)胞中的活性氧，從而維持植株正常的生理活動(dòng)。由圖3可知：鹽脅迫下月季葉片中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均增強(qiáng)，而外源褪黑素處理可以使抗氧化酶的活性顯著高于ck和T處理。鹽脅迫下，SOD活性顯著高于ck；當(dāng)外源褪黑素濃度增加時(shí)，SOD活性呈上升趨勢(shì)，S3處理的活性顯著高于S1、T和ck處理(P＜0.05)，但是S3與S2處理之間沒有顯著差異(圖3A)。鹽處理下，POD的活性顯著高于ck和T處理；當(dāng)外源褪黑素濃度增加時(shí)，其活性逐漸增加；S3處理的活性是T處理的1.7倍；S1和S2處理的POD活性顯著高于ck和T處理(P＜0.05)(圖3B)。此外，鹽脅迫可以顯著增加CAT的活性，S3處理的活性顯著高于ck、T和S1處理(P＜0.05)，與S2處理沒有顯著差異(圖3C)。表明外源褪黑素處理可以增強(qiáng)月季鹽脅下的抗氧化酶活性，從而減少活性氧的積累，緩解鹽脅迫下細(xì)胞的氧化傷害，維持細(xì)胞的完整性。

圖 3 不同處理下月季葉片超氧化物歧化酶(A)、過(guò)氧化物酶(B)和過(guò)氧化氫酶(C)活性的變化Figure 3 Activity change of SOD(A) , POD(B) and CAT(C) of rose leaves under different treatments

3 討論

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要外界因素之一[9]。近年來(lái)，褪黑素作為生理調(diào)節(jié)劑，對(duì)緩解植物在干旱、高溫、低溫、重金屬等逆境下氧化脅迫傷害具有積極作用[10?12]。本研究表明：外源褪黑素預(yù)處理可有效降低鹽脅迫下月季苗葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，增加抗壞血酸、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性，從而緩解月季苗的鹽分脅迫傷害。

正常植物細(xì)胞內(nèi)的鈉離子、鉀離子與鈣離子處于平衡狀態(tài)，從而使細(xì)胞保持完整性和通透性[13]。而一旦植物遭受鹽分脅迫，通常會(huì)使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度增加，打破離子平衡，迫使改變細(xì)胞的膜透性[14]。此外，鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞積累大量的活性氧(ROS)，導(dǎo)致膜脂發(fā)生過(guò)氧化，產(chǎn)生MDA，破壞膜的通透性[15]。本研究通過(guò)外源褪黑素處理，可以顯著抑制鹽脅迫條件下月季葉片MDA的積累(P＜0.05)，保護(hù)細(xì)胞膜的通透性。其作用機(jī)理可能是褪黑素作為一種信號(hào)分子，參與活性氧的清除，防止膜脂發(fā)生過(guò)氧化。

脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在抵制活性氧的細(xì)胞傷害中具有積極的作用[16]。植物體內(nèi)的脯氨酸可以增強(qiáng)細(xì)胞原生質(zhì)的親水性，提高植物組織細(xì)胞的持水性，防止植物細(xì)胞脫水，保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。張娜等[17]研究發(fā)現(xiàn)：在鹽脅迫條件下外源褪黑素處理狼尾草Pennisetum alopecuroides種子，其發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率顯著高于單獨(dú)鹽脅迫處理，且脯氨酸顯著增加，因此鹽脅迫所造成的滲透?jìng)︼@著降低。可溶性蛋白質(zhì)的增加和積累能提高植物細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用[18]。本研究表明：在鹽脅迫條件下月季幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，而外源褪黑素處理可以使葉片中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P＜0.05)，這可能是因?yàn)橥屎谒刈鳛橐环N信號(hào)物質(zhì)參與可溶性蛋白質(zhì)的合成。

抗壞血酸作為植物體內(nèi)重要的的抗氧化劑，在脅迫條件下能夠抑制活性氧的形成和積累，緩解植物的脅迫傷害[19]。本研究表明：褪黑素處理可以顯著提高鹽脅迫下月季幼苗葉片抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)?？赡茉蚴峭庠赐屎谒靥幚碚T導(dǎo)抗壞血酸的合成，增加抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而抗壞血酸的增加可以提高月季清除活性氧的能力，避免脂質(zhì)過(guò)氧化。綜上所述，鹽脅迫下外源褪黑素處理可以提高月季葉片抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)月季耐鹽性，緩解鹽脅迫的傷害。

植物在逆境條件下，會(huì)積累大量活性氧(ROS)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們可以清除細(xì)胞內(nèi)ROS，減少ROS的積累，防止脂質(zhì)過(guò)氧化[20]。高帆等[21]發(fā)現(xiàn)：外源褪黑素處理可以增強(qiáng)鹽脅迫下美味獼猴桃Aclinidia deliciosa苗抗氧化酶的活性，從而緩解鹽脅迫傷害。本研究表明：外源褪黑素處理可以顯著增加鹽脅迫下月季葉片SOD、POD和CAT的活性(P＜0.05)，從而增強(qiáng)月季清除ROS的能力，緩解月季鹽分脅迫傷害?？赡芤?yàn)橥庠赐屎谒靥幚碚T導(dǎo)激活抗氧化酶系統(tǒng)，使SOD、POD和CAT的活性大大增強(qiáng)，提高了月季的耐鹽性。