汪敦飛，朱勝男，肖清鐵,2，鄭新宇,2，林瑞余,2

（1. 福建農林大學 生命科學學院 福建省農業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室，福建 福州 350002；2. 福建農林大學 作物生態(tài)與分子生理學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002）

《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，中國耕地土壤污染點位超標率高達19.4%，重金屬污染點位超標率為15.5%，其中鎘的點位超標率為7.0%，居首位[1]。鎘是一種毒性很強的人體非必需元素，極易被作物吸收進入食物鏈，從而危害人體健康[2]。如何阻遏環(huán)境中的鎘進入食物鏈，已成為當前土壤及生態(tài)環(huán)境領域的研究熱點之一[3]。目前，微生物修復技術成為鎘污染治理的研究方向之一[4]。蔣成斌[5]篩選到2種耐鎘細菌：腐敗希瓦菌Shewanella putrefaciens和假單胞菌Pseudomonassp.，在LB(Luria-Bertani)固體和液體培養(yǎng)上耐受重金屬鎘離子(Cd2+)濃度分別達到150和40 mmol·L?1。張欣等[6]在模擬鎘輕度污染(1 mg·kg?1)試驗中通過施入微生物菌劑(枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、光合細菌和乳酸菌)后使菠菜Spinacia oleracea鎘含量平均下降14.5%。王微等[7]和何小三等[8]利用硅藻土制備的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa菌劑能夠顯著促進鎘脅迫苗期水稻Oryza sativa的生長，抑制鎘在根、莖鞘、葉片中的遷移與積累。汪敦飛等[9]研究指出：耐鎘銅綠假單胞菌及其菌劑能顯著提高鎘脅迫水稻苗期的根系活力，增強水稻葉片抗氧化酶系統(tǒng)的活力，提高水稻葉片抗氧化物的含量，從而有效緩解水稻鎘脅迫效應。假單胞菌為革蘭氏陰性菌，環(huán)境適應能力強，世代周期短，具有根際促生能力，已被廣泛用作生防菌[10?11]。本課題組前期從水稻根際土壤篩選了1株耐鎘的假單胞菌TCd-1，能在高達900 mg·L?1Cd2+下生長，在 100 mg·L?1鎘處理下，菌株體內吸收的鎘質量分數(shù)為 9.04 mg·g?1，鎘富集系數(shù)達到90.4，具有較強鎘富集能力，因此有應用于鎘污染的修復潛力[12]。但該菌株的培養(yǎng)條件有待優(yōu)化。響應面分析法是一種綜合試驗設計和數(shù)學建模的方法，既能有效減少試驗次數(shù)又能考察各個因素之間的交互作用[13?14]，在優(yōu)化試驗設計中，被人們廣泛使用[15]。胡瑞萍等[16]利用響應面法優(yōu)化了枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNHS1菌株培養(yǎng)基組分，使芽孢含量比優(yōu)化前提高1.5倍。印楊等[17]利用響應面法優(yōu)化了生防菌株(巨大芽孢桿菌Megaterium bacillusRB10)的發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)，證實了Box-Behnken設計的有效性和模型的準確可靠[17]。袁輝林[18]以植物促生菌SZ7-1為研究對象，在5 L自動發(fā)酵罐中采用單因素試驗設計及響應曲面法進行擴大培養(yǎng)，結果表明：優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更利于菌株的生長，且活菌數(shù)是優(yōu)化前的1.62倍。劉江紅等[19]通過響應面法優(yōu)化了芽孢桿菌BacillusS2的培養(yǎng)條件，使最優(yōu)乳化指數(shù)(E24)提高為81.20%。鞏志金等[20]利用響應面法優(yōu)化了銅綠假單胞菌產鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基，結果使其產量提高了14.43%。本研究基于響應面法通過單因素篩選試驗、Plackett-Burman試驗、Box-Behnken試驗和響應面分析法，對TCd-1菌株培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期為菌株潛在價值的開發(fā)利用和菌劑制備提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種及其活化培養(yǎng)

供試菌株為耐鎘的假單胞菌Pseudomonassp. TCd-1(專利號 CN 103952333A)[21]，甘油保存于?80 ℃冰箱。菌株活化時取出塑料凍存管，立即置于30～40 ℃恒溫水浴鍋中勻速搖動進行快速復蘇，待凍存管內結冰全部溶解后，開啟凍存管，將內容物轉移至種子液培養(yǎng)基內培養(yǎng)。

種子液培養(yǎng)條件：采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，1.0 L蒸餾水，pH 7.2～7.4)。菌株長出后選取直徑約為3 mm的菌落進行平板劃線法過夜培養(yǎng)，再從2次培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基上挑取1環(huán)菌落至100 mL 的三角瓶，150 r·min?1，37 ℃，恒溫培養(yǎng)18 h，制成菌株種子液。發(fā)酵培養(yǎng)條件：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL，質量分數(shù)為0.5%氯化鈉，1.0%種子液，150 r·min?1，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因素試驗 在發(fā)酵培養(yǎng)條件下，選擇不同氮源：N1為酵母粉，N2為硫酸銨 [(NH4)2SO4]，N3為硝酸銨(NH4NO3)，N4為蛋白胨，N5為硝酸鉀(KNO3)，N6為氯化銨(NH4Cl)，N7為硝酸納(NaNO3)，設置質量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5% 3個水平；不同碳源：C1為牛肉膏，C2為可溶性淀粉，C3為葡萄糖，C4為蔗糖，設置質量分數(shù)為0.1%、0.3%、0.5% 3個水平；不同無機鹽：W1為氯化鈣(CaCl2)，W2為氯化鎂(MgCl2)，W3為氯化鈉(NaCl)，W4為氯化鉀(KCl)，W5為磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，W6為硫酸鈉(Na2SO4)，W7為磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，設置質量分數(shù)為0.2%、0.5%、0.8% 3個水平。以菌株最大吸收波長660 nm下的吸光度D(660)作為評價指標，篩選最適的碳源、氮源、無機鹽及其質量分數(shù)。

1.2.2 Plackett-Burman 試驗根據(jù)單因素試驗得到的最適碳源 (牛肉膏)、氮源 (酵母粉)、無機鹽(MgCl2)，進行Plackett-Burman試驗。試驗設計如表1。試驗次數(shù)n=12，各因素水平設置為高低2個水平，高水平(1)取值為低水平(?1)的1.25倍，其中D、H、K為空白試驗，用于誤差估計?？疾炫Ｈ飧?A)、酵母粉(B)、MgCl2(C)、培養(yǎng)溫度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培養(yǎng)時間(I)和轉速(J) 8個因素對菌株生長的影響，確定影響菌株生長的關鍵因素。

表 1 Plackett-Burman 試驗設計因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.3 最陡爬坡及 Box-Behnken 試驗 根據(jù) Plackett-Burman 試驗篩選得到的顯著影響菌株生長的關鍵因素(酵母粉、溫度、初始pH)，確定最陡爬坡試驗的步長和方向，獲得最佳的響應區(qū)域。

以最陡爬坡試驗得到最佳響應區(qū)域(2號試驗)作為Box-Behnken試驗設計的中心點，各因素取3個水平，以(?1，0，1)表示，設計包括了5個中心點(0，0，0)，即酵母粉0.9%、溫度35 ℃、pH 7，共17個組合的響應面試驗。各處理3次重復。

1.2.4 響應面分析 根據(jù)Box-Behnken試驗結果，進行方差分析，并擬合線性回歸方程，檢驗擬合防方程的符合程度；利用擬合方程獲得最佳培養(yǎng)條件，并在最佳培養(yǎng)條件下進行驗證試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖使用 Excel 2016 進行，統(tǒng)計分析使用 Design Experts 10 和 IBM SPSS 22。試驗結果以平均值±標準差表示，采用Duncan法進行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

結果表明：碳源種類及其質量分數(shù)顯著影響菌株的生長(圖1A)，菌液吸光度隨牛肉膏、可溶性淀粉質量分數(shù)的提高而增大，而葡萄糖和蔗糖質量分數(shù)對菌液吸光度的影響較小。各處理中以0.5%牛肉膏培養(yǎng)的吸光度(1.257)最高，顯著高于其他各處理(P＜0.05)，比可溶性淀粉的最大值高10.8%，比葡萄糖和蔗糖的最大值分別提高了17.7%和23.6% (圖1A)。不同氮源及其質量分數(shù)顯著(P＜0.05)影響菌株的生長(圖1B)，有機氮源(酵母粉、蛋白胨)更利于菌株生長，各處理中以1.0%酵母粉處理的吸光度(1.266)最高，比1.0%蛋白胨高14.2%，比硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨和硝酸鈉處理的最大吸光度分別高出62.7%、79.8%、76.8%、52.7%、87.0%。不同無機鹽顯著(P＜0.05)影響菌株的生長(圖1C)。培養(yǎng)基含0.5%鎂離子時的菌液吸光度(1.197)最高，而鈣離子最不利于菌株生長；培養(yǎng)基含0.5%的氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鈉、磷酸二氫鈉與含0.8%的氯化鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉間無顯著性差異?？梢?，選擇0.5%牛肉膏、1.0%酵母粉及0.5% MgCl2作為基礎培養(yǎng)基是最合適的。

圖 1 不同碳源 (A)、氮源 (B)、無機鹽 (C)對菌株生長影響Figure 1 Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains

2.2 Plackett-Burman 試驗結果

Plackett-Burman試驗結果顯示：菌株生長在不同處理間存在顯著差異(表2)，以8號、9號、10號吸光度高，且之間無顯著性差異。9號吸光度 (1.802)最高，比最低5號(0.981)的值高83.7%。

進一步的因子分析(表3)結果表明：在設定的試驗條件下，顯著影響菌株生長的因子為酵母粉(B)、溫度(E)和pH (F)，顯著性程度從大到小依次為溫度、酵母粉、pH。確定這3個因素為影響菌株生長的關鍵因素，進行最陡爬坡試驗。

表 2 Plackett-Burman 試驗結果Table 2 Results of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗結果

參照表3因子的正負效應可知：因素B、因素E、因素F各具有不同正、負效應系數(shù)，即酵母粉(B)具有正效應(+)，依次增大；溫度(E)具有負效應(?)，依次減??；pH (F)具有負效應(?)，依次減小。

最陡爬坡試驗結果(表4)顯示：隨著酵母粉質量分數(shù)逐漸增大，溫度和pH逐漸減小，菌株吸光度呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。2號的吸光度達到最高水平(1.720)，比1號和3號分別高出2.3%和59.4%，以此確定為因子的最大相應值響應區(qū)域，即酵母粉質量分數(shù)為0.9%，溫度為35 ℃，pH 7的組合可作為Box-Behnken試驗設計的中心點(0，0，0)。

表 3 Plackett-Burman 試驗顯著性分析結果Table 3 Results of Plackett-Burman design

2.4 Box-Behnken 試驗結果

Box-Behnken試驗結果表明：不同試驗組合間存在顯著差異 (表 5)。14 號吸光度 (1.785)最高，比2號(0.922)高93.6%，即14號(0，0，0)：酵母粉質量分數(shù)為0.9%，溫度為35 ℃，pH 7條件下的吸光度高于2號(0，1，1)：酵母粉質量分數(shù)為0.8%，溫度為40 ℃，pH=7條件下的吸光度。

表 4 最陡爬坡試驗Table 4 Factors and levels of steepest ascent design

表 5 Box-Behnken 試驗設計Table 5 Results of Box-Behnken design

2.5 Box-Behnken 試驗回歸模型和方差分析結果

回歸模型的方差分析結果表明：模型多元相關性系數(shù)為0.9958 (表6)，表明僅有0.042 0%的變異不能由此模型解釋；回歸模型P＜0.01，表明模型是極顯著的。模型失擬項的顯著性水平P=0.146＞0.05，表明模型失擬不顯著。方差分析結果顯示，Box-Behnken設計的模型顯著性水平P＜0.000 1，表明所采用的擬合模型達到極顯著水平，具有統(tǒng)計學意義。由表6可知，3個因素的影響程度從大到小次序為溫度(E)、酵母粉(B)、pH(F)；B、E、F、E2對響應值Y(吸光度)的影響達到極顯著水平，EF顯著影響Y值。此外，回歸方程的相關系數(shù)R2=0.9958，變異系數(shù)為2.08%，說明該回歸方程擬合度高，變異幾率低，適用于該菌株試驗條件下各影響因素的統(tǒng)計分析。該響應面擬合方程為：Y=1.750 0+0.050 0B?0.307 0E?0.033 3F?4.000 0E?0.030 0BE?0.011 0BF?0.040 7EF?0.023 6B2?0.441 0E2?0.034 9F2。依據(jù)單因素和Plackett-Burman試驗的結果選擇設定的酵母粉(B)、溫度(E)和pH(F)的取值范圍，利用響應面擬合方程得到3個關鍵因素的擬合值：酵母粉為1.0%，pH為6.3，溫度為33 ℃。該擬合值條件下模型的預測吸光度最大，為1.856。

表 6 Box-Behnken 試驗回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test

2.6 優(yōu)化結果驗證

綜合單因素篩選試驗、Plackett-Burman及 Box-Behnken試驗模型的擬合值，得到菌株最佳培養(yǎng)條件為：牛肉膏質量分數(shù)為0.5%，酵母粉1.0%，氯化鎂 0.5%，pH 6.3，溫度33 ℃，接菌量1.25%，轉速160 r·min?1，培養(yǎng)時間 24 h。利用最佳培養(yǎng)條件，進行重復試驗驗證，得到菌液的吸光度為1.801±0.015，與模型預測的最大值(1.856)相接近，接近程度97.03%，表明模型準確可信，能真實評價各因素及其交互作用對菌株生長的不同影響。同時，與未優(yōu)化前培養(yǎng)條件下菌株吸光度(1.078±0.021)相比，優(yōu)化后該值提高了67.07%，達到預期目的。

3 討論與結論

3.1 Plackett-Burman 試驗中顯著因素對菌株生長影響

Plackett-Burman 是一種基于非完全平衡塊原理的近飽和的兩水平試驗設計方法。通過N次試驗最多可以考察N?1個因素，用最少試驗次數(shù)可以從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個主效因子，每個因素取低和高2個水平，高水平取低水平的1.25倍[22?23]。

在本試驗中，Plackett-Burman試驗從多個因素[牛肉膏(A)、酵母粉(B)、氯化鎂(C)、培養(yǎng)溫度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培養(yǎng)時間(I)和轉速(J)]中快速篩選出具有顯著影響的因素為：酵母粉、pH和溫度。其中酵母粉之所以能顯著影響菌株生長，在于它能提供優(yōu)質氮源滿足細菌繁殖所必需，而且天然酵母粉主要由多種酵母菌自然繁殖而成，是一種純天然、無污染的健康營養(yǎng)源[24]。有機氮源比無機氮源含有更豐富的氨基酸、維生素及生長因子等營養(yǎng)物質，其中氨基酸可以直接參與微生物體內的轉氨或脫氨作用(圖1)，更適用于菌株生長。溫度是諸多因素中顯著影響因素之一，因為可能隨著溫度升高，菌體生長速度及營養(yǎng)消耗的速率也隨之加快，明顯縮短進入生長穩(wěn)定期的時間；從酶本身特性來看，酶具有高效催化性，能夠降低生化反應的活化能，但酶本身作用條件較溫和，對溫度比較敏感，很容易因溫度過高而喪失活性[25]。溫度也會影響細胞膜的流動性，進而影響膜內外物質(水分、有機物、各種離子等)的交換和吸收。pH 顯著影響菌株生長速率可能在于其對菌株生長需要的酶、各種生物大分子的穩(wěn)定性造成破壞等，導致失去生物活性；pH也會影響到培養(yǎng)基中金屬離子的存在形式，造成其不易或者不被吸收；pH同樣會影響微生物細胞膜所帶電荷狀態(tài)，進而改變細胞膜的通透性，最終直接或間接影響微生物對所需營養(yǎng)物質的吸收和代謝產物的排出。

3.2 響應面在優(yōu)化培養(yǎng)條件的應用

響應面分析是利用統(tǒng)計學和數(shù)學模型的方法對需要優(yōu)化的多因素系統(tǒng)進行建模和分析[13?15]，Box-Behnken試驗設計是其中擬合模型之一，目前常被用于生物發(fā)酵過程培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。該方法不僅可以建立連續(xù)變量的曲面模型和擬合方程，還可以對影響微生物生長和發(fā)酵過程的各種因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平范圍，通過最少的試驗組數(shù)獲得更為精確有效的結論，極大地節(jié)約資源和降低成本，使其效應最大化[26]。

細菌生長和培養(yǎng)是一個動態(tài)發(fā)酵過程，受外部發(fā)酵環(huán)境以及內部培養(yǎng)基成分的共同影響。此次試驗以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗確定菌株培養(yǎng)基組分和外部培養(yǎng)條件，系統(tǒng)優(yōu)化了重金屬鎘耐性假單胞菌TCd-1培養(yǎng)體系，為后續(xù)進一步深入研究其菌劑制備及應用于重金屬鎘污染土壤的修復效應奠定了基礎。