楊 超，朱 朕，李 靜，孫運(yùn)恒，歐陽(yáng)雪巖，王佳唯，黃 騫，丁 罡，王耀晟*，姜 峰*

1. 新華醫(yī)院崇明分院癌痛轉(zhuǎn)化研究所，上海 202150 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/醫(yī)學(xué)院，上海 200436 3. 上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心腫瘤科，上海 201318 4. 河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003 5. 仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所，上海 200032

引 言

世界衛(wèi)生組織2018年全球最新癌癥報(bào)告指出，全球新增1810萬(wàn)例癌癥病例，死亡人數(shù)達(dá)960萬(wàn)，中國(guó)癌癥的發(fā)病率居世界第一位，肺癌，乳腺癌是中國(guó)最常見(jiàn)的癌癥[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺癌與乳腺癌患者當(dāng)中，因骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高、放化療造成的相關(guān)疼痛情況較為常見(jiàn)[2]。Substance P(SP, P物質(zhì))作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于神經(jīng)元、神經(jīng)纖維末梢和免疫細(xì)胞，通過(guò)與細(xì)胞膜上NK-1受體結(jié)合發(fā)揮其作用，即介導(dǎo)疼痛與調(diào)制免疫[3-4]。P物質(zhì)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展，如P物質(zhì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展；皮膚腫瘤可能會(huì)受到神經(jīng)末梢釋放的如P物質(zhì)等神經(jīng)內(nèi)分泌因子影響而加快進(jìn)展速度；子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌中P物質(zhì)與其受體的高表達(dá)也會(huì)提高腫瘤發(fā)展進(jìn)程、愈后較差；在乳腺癌中P物質(zhì)的刺激可造成腫瘤細(xì)胞的化療抵抗[5-8]。因此研究P物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性(核酸、蛋白、脂類)的改變，有助于進(jìn)一步了解疼痛促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制。光譜學(xué)技術(shù)在癌癥的診斷領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用[9-10]，傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)作為光學(xué)技術(shù)的一種，能夠有效地探測(cè)細(xì)胞樣本中的化學(xué)組成及其分布，例如，紅外光譜可以檢測(cè)細(xì)胞樣本中核酸、蛋白、脂類及碳水化合物的含量，同時(shí)，還可以檢測(cè)生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，紅外光譜能根據(jù)細(xì)胞樣本的特征性光譜來(lái)區(qū)分不同生理或病理狀態(tài)的細(xì)胞[11-14]。相比傳統(tǒng)紅外光源，同步輻射光源在中紅外光波段的亮度有100～1 000倍的提高。同步輻射紅外光譜顯微成像技術(shù)(synchrotron radiation based-Fourier transform infrared microspectroscopy, SR-FTIR)能夠在細(xì)胞水平對(duì)生物組織或細(xì)胞中包含的各種生物化學(xué)分子的代謝狀態(tài)進(jìn)行分析。本工作在乳腺癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中加入P物質(zhì)培養(yǎng)24 h，對(duì)正常培養(yǎng)細(xì)胞和加入P物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行同步輻射紅外光譜顯微成像技術(shù)光譜成像，研究P物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生物大分子的代謝改變。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞株A549與SPCA-1，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-231均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。4株細(xì)胞均使用含10%胎牛血清，含有100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素以及2.5 μg·mL-1兩性霉素的DMEM高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)；細(xì)胞在5% CO2，37 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)皿底部預(yù)先鋪設(shè)高溫滅菌的BaF2玻片，BaF2玻片上細(xì)胞密度達(dá)到80%以上后分別加入預(yù)先制備好、不含P物質(zhì)的培養(yǎng)基和含有0～10-8mol·L-1P物質(zhì)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出附著細(xì)胞樣本的玻片自然風(fēng)干24 h，測(cè)定光譜前置于封閉干燥的器皿中防止空氣中水分干擾。

1.2 光譜采集

光譜數(shù)據(jù)采集在合肥國(guó)家同步輻射實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。使用儀器包括：傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)，紅外顯微鏡(Hyperion 3000), Single-point探測(cè)器，操作軟件OPUS 6.5。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持儀器處于超低溫狀態(tài)。以7 μm×7 μm的狹縫覆蓋所測(cè)細(xì)胞，光圈大小為20 μm×20 μm。在玻片上選擇一個(gè)干凈、無(wú)樣本的點(diǎn)獲取背景光譜。為了避免樣品周圍空氣變化，每次加液氮后以及更換新的樣品玻片后都需重新采集背景光譜。按照上述方法依次對(duì)每組不同編號(hào)的樣品進(jìn)行光譜測(cè)定。光譜掃描范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為8 cm-1，每個(gè)樣品掃描累加次數(shù)為20次以減少信噪比。維持12次·h-1的樣品光譜測(cè)定速度。采用OPUS 6.5軟件R 3.6.0軟件處理數(shù)據(jù)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間比較使用t-Test。

2 結(jié)果與討論

在晚期腫瘤患者中進(jìn)行的臨床研究表明，癌痛肺癌患者和癌痛乳腺癌患者血清中P物質(zhì)的表達(dá)量高于無(wú)疼痛的患者。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，P物質(zhì)可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。P物質(zhì)含量的增加是否影響腫瘤細(xì)代謝，改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物大分子的含量和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。本研究通過(guò)同步輻射紅外光譜成像技術(shù)繪制了正常培養(yǎng)的四種腫瘤細(xì)胞系(乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，MCF-7及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，SPCA-1)的紅外光譜圖及P物質(zhì)處理四種腫瘤細(xì)胞系的紅外光譜圖(圖1)。表1中，位于1 070～1 090 cm-1區(qū)段的PO2對(duì)稱拉伸振動(dòng)和1 230～1 250 cm-1區(qū)段的PO2反對(duì)稱拉伸振動(dòng)能夠反映核酸的濃度變化，位于1 500～1 600 cm-1區(qū)段的酰胺Ⅱ和1 600～1 700 cm-1區(qū)段的酰胺Ⅰ可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及濃度變化，脂類基團(tuán)的吸收譜帶集中在1 700～1 800 cm-1和2 800～2 950 cm-1，以上兩個(gè)譜帶可以反映脂類的變化情況，990～1 040和3 300～3 500 cm-1則反映碳水化合物變化情況[15]。

圖1 四種細(xì)胞系紅外光譜吸收?qǐng)D譜Fig.1 FTIR spectra of four cell lines

表1 紅外吸收光譜中各生化分子基團(tuán)譜帶指認(rèn)Table 1 The bands frequencies assigned for the IR spectra

通過(guò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系紅外光譜的峰位分析(表2)，SP處理乳腺癌系MDA-MB-231，MCF-7后，MDA-MB-231紅外光譜中，位于1 500～1 600 cm-1的酰胺Ⅱ吸收峰和1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ吸收峰分別由(1 548.086±0.941)和(1 651.678±4.705) cm-1移動(dòng)到(1 538.719±1.712)和(1 639.555±3.419) cm-1(p<0.05)，在MCF-7紅外光譜圖峰位也分別從(1 547.432±3.082)和(1 647.235±4.426) cm-1移動(dòng)到(1 538.03±4.25)和(1 636.869±3.391) cm-1(p<0.05)。其他分子峰位無(wú)明顯改變。同時(shí)，在MDA-MB-231細(xì)胞系中，SP處理組細(xì)胞光譜位于1 500～1 600 cm-1的酰胺Ⅱ吸收峰和1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ吸收峰低于對(duì)照組(表3)，差異均有顯著性(p<0.05)。有無(wú)SP刺激對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞系在脂類和碳水化合物指紋區(qū)段的峰位及峰強(qiáng)度均無(wú)明顯影響。

表2 乳腺癌細(xì)胞系光譜峰位統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Spectral peak analysis of breast cancer cell lines

在肺癌細(xì)胞系中，A549和SPCA-1的紅外光譜中，位于1 500～1 600 cm-1的酰胺Ⅱ吸收峰和1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ吸收峰也有10 cm-1以上的藍(lán)移(p<0.05)。A549細(xì)胞系中，位于1 070～1 090和1 230～1 250 cm-1的PO2的吸收峰也有明顯的藍(lán)移(p<0.05)(表3)。SP處理組A549細(xì)胞，光譜位于1 500～1 600 cm-1的酰胺Ⅱ吸收峰和1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ吸收峰強(qiáng)度低于對(duì)照組(表4)，差異均有顯著性(p<0.05)。在脂類及碳水化合物指紋區(qū)段，有無(wú)SP刺激對(duì)兩種肺癌細(xì)胞系的峰位及峰高均無(wú)明顯影響。

表3 乳腺癌細(xì)胞系光譜峰統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of spectral peak of breast cancer cell lines

表4 肺癌細(xì)胞系光譜峰位統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Spectral peak analysis of lung cancer cell lines

酰胺Ⅰ的振動(dòng)頻率位于1 655 cm-1附近，酰胺Ⅱ的振動(dòng)頻率位于1 545 cm-1附近，因此，通過(guò)紅外吸收光譜的生化分子基團(tuán)頻率指認(rèn)，在四種細(xì)胞系中峰位發(fā)生藍(lán)移的為酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰，提示SP刺激以上四種腫瘤細(xì)胞系可能引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)異常，這可能是引起腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性改變的重要原因。此外，使用SP刺激肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549后，A549的紅外光譜1 070～1 090 cm-1和1 230～1 250 cm-1出現(xiàn)藍(lán)移(p<0.05)，這兩個(gè)波段分別被指與核酸中磷酸二酯鍵的對(duì)稱振動(dòng)和反對(duì)稱振動(dòng)相關(guān)聯(lián)，這可能與腫瘤細(xì)胞DNA(癌基因和抑癌基因)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。

通過(guò)對(duì)SP處理組和對(duì)照組細(xì)胞的紅外光譜峰位統(tǒng)計(jì)，可以分析SP處理對(duì)腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及DNA結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)相對(duì)吸收峰強(qiáng)度可以分析細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂類及碳水化合物的含量變化。圖1顯示，四種細(xì)胞系中，SP處理組在大部分指認(rèn)相關(guān)區(qū)段的峰高低于對(duì)照組，但大部分不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)，但在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰強(qiáng)度低于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)(表3、表5)。結(jié)合SP處理腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，推測(cè)可能原因是，腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞分裂速度加快，導(dǎo)致新生腫瘤細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)蛋白合成減少，例如細(xì)胞骨架蛋白部分組分，細(xì)胞膜蛋白(纖連粘蛋白)等，從而提高了腫瘤細(xì)胞的形變能力以及降低腫瘤細(xì)胞黏附能力，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

表5 肺癌細(xì)胞系光譜吸收峰變化統(tǒng)計(jì)分析Table 5 Statistical analysis of spectral peak of lung cancer cell lines

4 結(jié) 論

紅外光譜分析表明SP刺激與否顯著改變了腫瘤細(xì)胞的光譜學(xué)結(jié)果，與蛋白相關(guān)的吸收峰的藍(lán)移提示細(xì)胞內(nèi)整體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)，部分腫瘤細(xì)胞系內(nèi)與核酸相關(guān)的吸收峰藍(lán)移揭示了微環(huán)境中SP對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝特性影響的復(fù)雜性。對(duì)于更好地解釋持續(xù)性疼痛調(diào)控腫瘤增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)機(jī)制具有重要意義，為人類更好地理解腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移研究提供了新的視角和新的思路。

致謝：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)國(guó)家同步輻射實(shí)驗(yàn)室的大力支持。