高瑞琳，楊鵬碩，許 剛，武曉文，楊 暢，史新元*

1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488 2. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075

引 言

腦心通膠囊為黃芪、赤芍、丹參、全蝎、水蛭等16味藥材粉碎加工制成的中藥復方制劑，具有益氣活血、化瘀通絡的功效，臨床上治療心腦血管疾病具有顯著療效[1]。目前，腦心通膠囊的質(zhì)量控制主要采用指紋圖譜分析及指標成分丹酚酸B定量分析的方法[2]，檢測過程繁瑣費時，且難以實現(xiàn)腦心通膠囊制劑過程中間體的快速評價和質(zhì)量控制。

近年來，近紅外光譜(near-infrared spectroscopy，NIR)分析技術憑借其快速、可靠、無損、環(huán)保等優(yōu)勢，在中藥材、中藥制劑[3]、中藥生產(chǎn)過程以及藥物質(zhì)量快速評價[4]中得到日益廣泛的應用[5]。穩(wěn)健可靠的定量模型是近紅外技術成功應用的前提和保證。常規(guī)近紅外定量建模過程采用逐步優(yōu)化的思路[6]，這樣的建模思路并未充分考慮建模參數(shù)間的關聯(lián)性對模型性能的影響，致使定量模型的質(zhì)量存在風險[7]。系統(tǒng)建模思想[7]將建模過程看作一個整體，將樣本集選擇、光譜預處理、變量篩選、校正等作為要素，基于要素間的關聯(lián)性對建模參數(shù)軌跡進行全局優(yōu)選，采用最優(yōu)參數(shù)軌跡構建模型，保障了模型質(zhì)量。本研究基于這一思想，采用D-最優(yōu)設計以關鍵建模參數(shù)為自變量，模型評價指標為因變量，基于參數(shù)間關聯(lián)性進行多次建模試驗，根據(jù)定量建模結(jié)果擬合預測模型，以最優(yōu)模型性能為目標對建模參數(shù)軌跡進行全局優(yōu)選，優(yōu)選出最佳參數(shù)軌跡，建立了穩(wěn)健的丹酚酸B偏最小二乘法(partial least square，PLS)定量模型，為腦心通膠囊生產(chǎn)過程及產(chǎn)品的快速質(zhì)量評價提供有效方法。

1 實驗部分

1.1 儀器

Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)配備InGaAs檢測器，積分球漫反射采樣系統(tǒng)，Result操作軟件；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；拜杰高速多功能粉碎機BJ-400A型，BP211D型電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

乙腈(色譜純，批號175157，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，甲醇(分析純，批號20170515，北京化工廠)，丹酚酸B(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號P10J9F52565)。丹參藥材由陜西步長制藥有限公司提供。將丹參藥材隨機編號，粉碎，過六號篩，低溫干燥后備用。

1.3 丹酚酸B的含量測定

1.3.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相為乙腈(A)和0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，23%A；20～25 min，23%～95%A；25～35 min，95%～23%A；35～40 min，23%A)，檢測波長286 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液制備

精密稱取丹酚酸B對照品適量，加80%甲醇配制成濃度為2.002 mg·mL-1對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備

取樣品細粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%的甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷后，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 線性關系考察

精密量取丹酚酸B對照品溶液0.05，0.25，1.0，2.0和2.5 mL，分別用80%甲醇稀釋于5 mL容量瓶中，即得各系列濃度對照品溶液。對照品溶液進樣10 μL，測定峰面積，作為線性關系考察。

1.3.4.2 精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率考察

精密吸取丹酚酸B對照品溶液，重復進樣6次，測定丹酚酸B峰面積值，作為精密度考察；取同一份供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12和24 h進樣分析，測定丹酚酸B峰面積值，作為穩(wěn)定性考察；精密稱取同一批丹參樣品6份，按照1.3.3節(jié)所述方法制備供試品溶液，進樣分析，測定丹酚酸B含量，作為重復性考察；精密稱取6份已知含量的丹參樣品約0.3 g，分別精密加入對照品溶液3.5 mL，按供試品制備方法制備，進樣分析，測定丹酚酸B峰面積，作為回收率考察。

1.3.5 樣品測定

分別精密吸取對照品和供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄40 min色譜圖。見圖1。

圖1 對照品(a)和丹參樣品(b)的HPLC圖

1.4 近紅外漫反射光譜采集

以積分球漫反射方式采集近紅外光譜，光譜采集范圍為4 000～10 000 cm-1，分辨率8 cm-1，掃描32次，增益8，以儀器內(nèi)置背景為參照，對56份丹參樣品進行光譜采集，每份樣品重復測定3次，取其平均光譜作為丹參各樣品的近紅外光譜。丹參樣品的原始近紅外光譜圖見圖2。

圖2 丹參樣品的原始近紅外光譜圖Fig.2 The raw spectra of Salvia miltiorrhiza samples

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Unscrambler7.0(挪威CAMO公司)軟件對光譜進行預處理。采用Matlab7.0(美國Mathwork公司)軟件進行變量篩選及模型計算。

1.6 建模參數(shù)及評價指標確定

1.7 基于D-最優(yōu)試驗設計的參數(shù)軌跡優(yōu)選及模型建立

表1 D-最優(yōu)試驗設計因素水平表Table 1 Experimental factor levels and response variables for the D-optimal design

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC的方法學考察

依據(jù)1.3.4節(jié)所述方法對系列對照品溶液進行含量測定，以濃度(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算得標準曲線為y=11 712x-124.35，相關系數(shù)R2=0.999 9，表明丹酚酸B對照品濃度在0.020 0～1.001 0 mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好；精密度考察中各對照品峰面積的RSD為0.80%，表明儀器的精密度良好；穩(wěn)定性考察中供試品丹酚酸B峰面積的RSD為0.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復性考察測得供試品中丹酚酸B的含量分別為0.065 42，0.066 48，0.067 19，0.066 38，0.065 38和0.066 21 mg·mg-1，RSD為1.04%，表明方法的重復性良好；測得丹酚酸B的回收率處于99%～103%范圍內(nèi)，RSD為1.38%，表明方法準確度良好。方法學考察結(jié)果表明，線性關系、精密度、穩(wěn)定性、重復性及加樣回收率均符合要求，表明丹酚酸B含量測定方法可靠。

2.2 D-最優(yōu)設計方案及結(jié)果

根據(jù)D-最優(yōu)試驗設計因素水平表設計進行55次試驗，按照試驗表中建模參數(shù)軌跡建立定量模型，并對模型的性能進行評價。D-最優(yōu)試驗設計及結(jié)果見表2。由表2可知，不同的建模參數(shù)軌跡構建的PLS定量模型在性能方面表現(xiàn)出顯著的差異。因此可以看出，優(yōu)選最佳建模參數(shù)對于構建穩(wěn)健的定量模型尤為重要。

表2 D-最優(yōu)試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental results of D-optimal design

續(xù)表2

2.3 丹酚酸B定量模型的建模參數(shù)軌跡優(yōu)選

表3 模型擬合與分析結(jié)果Table 3 Model fitting and analysis results

2.4 定量模型的建立與評價

3 結(jié) 論

基于系統(tǒng)建模思想，采用科學系統(tǒng)的D-最優(yōu)設計以關鍵建模參數(shù)為自變量，模型評價指標為因變量，基于參數(shù)間的關聯(lián)性進行多次建模試驗。試驗充分考察了建模參數(shù)間協(xié)同關系對模型性能的影響，以最優(yōu)模型性能為目標優(yōu)選出最佳的建模參數(shù)軌跡，構建了全局最優(yōu)的丹酚酸B近紅外定量模型。該模型的穩(wěn)健性和預測準確度高，可實現(xiàn)丹酚酸B含量的快速測定，為高效、快速、無損地獲取腦心通膠囊中丹酚酸B含量提供保證，對腦心通膠囊的質(zhì)量控制具有重要意義。

圖3 丹酚酸B含量預測值與真實值相關關系圖Fig.3 Correlation between the prediction and reference values of salvianolic acid B