高瑞琳,楊鵬碩,許 剛,武曉文,楊 暢,史新元*
1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488 2. 陜西步長制藥有限公司,陜西 西安 710075
腦心通膠囊為黃芪、赤芍、丹參、全蝎、水蛭等16味藥材粉碎加工制成的中藥復(fù)方制劑,具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效,臨床上治療心腦血管疾病具有顯著療效[1]。目前,腦心通膠囊的質(zhì)量控制主要采用指紋圖譜分析及指標(biāo)成分丹酚酸B定量分析的方法[2],檢測過程繁瑣費(fèi)時(shí),且難以實(shí)現(xiàn)腦心通膠囊制劑過程中間體的快速評價(jià)和質(zhì)量控制。
近年來,近紅外光譜(near-infrared spectroscopy,NIR)分析技術(shù)憑借其快速、可靠、無損、環(huán)保等優(yōu)勢,在中藥材、中藥制劑[3]、中藥生產(chǎn)過程以及藥物質(zhì)量快速評價(jià)[4]中得到日益廣泛的應(yīng)用[5]。穩(wěn)健可靠的定量模型是近紅外技術(shù)成功應(yīng)用的前提和保證。常規(guī)近紅外定量建模過程采用逐步優(yōu)化的思路[6],這樣的建模思路并未充分考慮建模參數(shù)間的關(guān)聯(lián)性對模型性能的影響,致使定量模型的質(zhì)量存在風(fēng)險(xiǎn)[7]。系統(tǒng)建模思想[7]將建模過程看作一個(gè)整體,將樣本集選擇、光譜預(yù)處理、變量篩選、校正等作為要素,基于要素間的關(guān)聯(lián)性對建模參數(shù)軌跡進(jìn)行全局優(yōu)選,采用最優(yōu)參數(shù)軌跡構(gòu)建模型,保障了模型質(zhì)量。本研究基于這一思想,采用D-最優(yōu)設(shè)計(jì)以關(guān)鍵建模參數(shù)為自變量,模型評價(jià)指標(biāo)為因變量,基于參數(shù)間關(guān)聯(lián)性進(jìn)行多次建模試驗(yàn),根據(jù)定量建模結(jié)果擬合預(yù)測模型,以最優(yōu)模型性能為目標(biāo)對建模參數(shù)軌跡進(jìn)行全局優(yōu)選,優(yōu)選出最佳參數(shù)軌跡,建立了穩(wěn)健的丹酚酸B偏最小二乘法(partial least square,PLS)定量模型,為腦心通膠囊生產(chǎn)過程及產(chǎn)品的快速質(zhì)量評價(jià)提供有效方法。
Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)配備InGaAs檢測器,積分球漫反射采樣系統(tǒng),Result操作軟件;Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);拜杰高速多功能粉碎機(jī)BJ-400A型,BP211D型電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。
乙腈(色譜純,批號175157,賽默飛世爾科技(中國)有限公司),蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司),甲醇(分析純,批號20170515,北京化工廠),丹酚酸B(上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%,批號P10J9F52565)。丹參藥材由陜西步長制藥有限公司提供。將丹參藥材隨機(jī)編號,粉碎,過六號篩,低溫干燥后備用。
1.3.1 色譜條件
采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為乙腈(A)和0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~20 min,23%A;20~25 min,23%~95%A;25~35 min,95%~23%A;35~40 min,23%A),檢測波長286 nm,流速1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。
1.3.2 對照品溶液制備
精密稱取丹酚酸B對照品適量,加80%甲醇配制成濃度為2.002 mg·mL-1對照品溶液。
1.3.3 供試品溶液制備
取樣品細(xì)粉約0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入80%的甲醇50 mL,稱定重量,超聲提取30 min,放冷后,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
1.3.4 方法學(xué)考察
1.3.4.1 線性關(guān)系考察
精密量取丹酚酸B對照品溶液0.05,0.25,1.0,2.0和2.5 mL,分別用80%甲醇稀釋于5 mL容量瓶中,即得各系列濃度對照品溶液。對照品溶液進(jìn)樣10 μL,測定峰面積,作為線性關(guān)系考察。
1.3.4.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率考察
精密吸取丹酚酸B對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定丹酚酸B峰面積值,作為精密度考察;取同一份供試品溶液,分別于制備后0,2,4,8,12和24 h進(jìn)樣分析,測定丹酚酸B峰面積值,作為穩(wěn)定性考察;精密稱取同一批丹參樣品6份,按照1.3.3節(jié)所述方法制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,測定丹酚酸B含量,作為重復(fù)性考察;精密稱取6份已知含量的丹參樣品約0.3 g,分別精密加入對照品溶液3.5 mL,按供試品制備方法制備,進(jìn)樣分析,測定丹酚酸B峰面積,作為回收率考察。
1.3.5 樣品測定
分別精密吸取對照品和供試品溶液10 μL注入液相色譜儀,記錄40 min色譜圖。見圖1。
圖1 對照品(a)和丹參樣品(b)的HPLC圖
以積分球漫反射方式采集近紅外光譜,光譜采集范圍為4 000~10 000 cm-1,分辨率8 cm-1,掃描32次,增益8,以儀器內(nèi)置背景為參照,對56份丹參樣品進(jìn)行光譜采集,每份樣品重復(fù)測定3次,取其平均光譜作為丹參各樣品的近紅外光譜。丹參樣品的原始近紅外光譜圖見圖2。
圖2 丹參樣品的原始近紅外光譜圖Fig.2 The raw spectra of Salvia miltiorrhiza samples
運(yùn)用Unscrambler7.0(挪威CAMO公司)軟件對光譜進(jìn)行預(yù)處理。采用Matlab7.0(美國Mathwork公司)軟件進(jìn)行變量篩選及模型計(jì)算。
表1 D-最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Experimental factor levels and response variables for the D-optimal design
依據(jù)1.3.4節(jié)所述方法對系列對照品溶液進(jìn)行含量測定,以濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11 712x-124.35,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9,表明丹酚酸B對照品濃度在0.020 0~1.001 0 mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;精密度考察中各對照品峰面積的RSD為0.80%,表明儀器的精密度良好;穩(wěn)定性考察中供試品丹酚酸B峰面積的RSD為0.95%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好;重復(fù)性考察測得供試品中丹酚酸B的含量分別為0.065 42,0.066 48,0.067 19,0.066 38,0.065 38和0.066 21 mg·mg-1,RSD為1.04%,表明方法的重復(fù)性良好;測得丹酚酸B的回收率處于99%~103%范圍內(nèi),RSD為1.38%,表明方法準(zhǔn)確度良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明,線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率均符合要求,表明丹酚酸B含量測定方法可靠。
根據(jù)D-最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表設(shè)計(jì)進(jìn)行55次試驗(yàn),按照試驗(yàn)表中建模參數(shù)軌跡建立定量模型,并對模型的性能進(jìn)行評價(jià)。D-最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。由表2可知,不同的建模參數(shù)軌跡構(gòu)建的PLS定量模型在性能方面表現(xiàn)出顯著的差異。因此可以看出,優(yōu)選最佳建模參數(shù)對于構(gòu)建穩(wěn)健的定量模型尤為重要。
表2 D-最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental results of D-optimal design
續(xù)表2
表3 模型擬合與分析結(jié)果Table 3 Model fitting and analysis results
基于系統(tǒng)建模思想,采用科學(xué)系統(tǒng)的D-最優(yōu)設(shè)計(jì)以關(guān)鍵建模參數(shù)為自變量,模型評價(jià)指標(biāo)為因變量,基于參數(shù)間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行多次建模試驗(yàn)。試驗(yàn)充分考察了建模參數(shù)間協(xié)同關(guān)系對模型性能的影響,以最優(yōu)模型性能為目標(biāo)優(yōu)選出最佳的建模參數(shù)軌跡,構(gòu)建了全局最優(yōu)的丹酚酸B近紅外定量模型。該模型的穩(wěn)健性和預(yù)測準(zhǔn)確度高,可實(shí)現(xiàn)丹酚酸B含量的快速測定,為高效、快速、無損地獲取腦心通膠囊中丹酚酸B含量提供保證,對腦心通膠囊的質(zhì)量控制具有重要意義。
圖3 丹酚酸B含量預(yù)測值與真實(shí)值相關(guān)關(guān)系圖Fig.3 Correlation between the prediction and reference values of salvianolic acid B