黃 曄，劉 麗，梁 晶，楊紅霞，李曉麗，徐 寧*

1. 浙江省皮膚病防治研究所藥劑科，浙江 德清 313200 2. 浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014 3. 湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000 4. 浙江大學食品及生物工程學院，浙江 杭州 310058

引 言

中藥配方顆粒因便于服用、保存和攜帶等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛流通于全國醫(yī)院。目前已獲得各類中藥配方顆粒試點資質(zhì)的企業(yè)高達57家，然而顆粒劑的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制還沒有建立統(tǒng)一的國家標準。同一品種因生產(chǎn)企業(yè)不同仍存在較大差異。蒼術為菊科植物茅蒼術或北蒼術的干燥根莖，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效[1]。蒼術顆粒劑無法像飲片一樣通過性狀、顯微鑒別區(qū)分品種和產(chǎn)地信息，亦無法通過高效液相色譜法對蒼術素有效定量。主要采用薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、水分測定法、浸出物測定法等，對其有效成分與含量進行初步的質(zhì)量檢測，因此開拓新的有效的質(zhì)量控制方法具有重要意義。

高光譜成像技術具有高效準確，無損、無污染的優(yōu)點[2-3]。國內(nèi)外學者已嘗試通過高光譜成像技術應用于中藥材的質(zhì)量控制，包括中藥年份鑒別、品種鑒別等。有報道研究了高光譜技術結合化學計量學對不同年份及放置方式的陳皮建立鑒別模型，預測準確率達98.33%，為陳皮年份無損鑒別提供了新的技術參考。Tankeu等[4]利用高光譜成像技術結合偏最小二乘判別分析，區(qū)分出粉防己和廣防己這兩種外觀形態(tài)相似、實則來源不同科屬、化學成分截然不同的兩種植物，可以有效防止廣防己混入粉防己。大多數(shù)的研究集中于簡單區(qū)分與防偽，探索高光譜成像技術應用于中藥現(xiàn)代化快速無損分析的過程中，如何優(yōu)選樣品光譜特征波段，建立準確度高、預測效果好的模型仍是亟需解決的問題。僅李超等[5](Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)對國內(nèi)8省份18產(chǎn)區(qū)的蒼術樣品建立了紅外指紋圖譜，而高光譜成像的蒼術配方顆粒研究尚無報道。

本工作研究了在高光譜874～1 734 nm區(qū)域3個不同生產(chǎn)廠家的蒼術配方顆粒圖譜信息，結合9種波段數(shù)據(jù)分別建立4種判別模型來尋找潛在的信息，對不同廠家的蒼術顆粒劑進行快速區(qū)分，并將結果可視化。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

浙江惠松制藥有限公司(廠家A，浙江杭州)、江陰天江藥業(yè)有限公司(廠家B，江蘇江陰)、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(廠家C，廣東深圳)的蒼術配方顆粒各50份，共150份樣本。

高光譜成像系統(tǒng)主要包括分辨率為672×512的CCD相機(C8484-05, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan)，分辨率為2.8 nm的光譜儀(ImSpector N17E; Spectral Imaging Ltd, Oulu, Finland)，線光源(Fiber-Lite DC950, Dolan Jenner Industries Inc, Boxborough, MA)，計算機，暗箱和電控移動平臺。高光譜圖像采集前，首先獲取暗電流和參考板的高光譜圖像數(shù)據(jù)，用于數(shù)據(jù)處理前對原始高光譜圖像的校正。電控移動平臺移動速度為17 mm·s-1，工作距離為20.5 cm，曝光時間2.4 ms，采集在874～1 734 nm范圍樣本的高光譜信息。

1.2 薄層色譜

薄層色譜法步驟參照《中國藥典》2015年版四部 通則0502。

1.3 光譜數(shù)據(jù)及圖像處理

蒼術顆粒劑樣本分別置于96孔板中，保證每個樣本在同一高度。黑白校正后設置樣本區(qū)域作為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，計算出每個樣本ROI范圍內(nèi)874～1 734 nm的平均光譜。采用偏最小二乘判別分析(partial least square discrimination analysis，PLS-DA)、最小二乘支持向量機(least-squares support vector machine，LS-SVM)、反向人工神經(jīng)網(wǎng)絡(back propagation neural network，BPNN)、鄰近算法(k-nearest neighbor，KNN)、競爭性自適應重加權采樣法(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)、隨機蛙跳算法(random frog，RF)[6]、連續(xù)投影算法(successive projections algorithm，SPA)、序列前向選擇算法(sequential forward selection，SFS)[7]以及相關性分析(correlation analysis，CA)采用Matlab R2018a(The Math Works, Natick, USA)處理。

2 結果與討論

2.1 蒼術顆粒劑的薄層色譜鑒定及平均高光譜

對應蒼術對照藥材薄層色譜的相同位置，各樣品的熒光斑點顏色一致，見圖1(a)。雖然三個樣品的薄層色譜有些許差別，但不能確認樣品的生產(chǎn)商。

蒼術顆粒劑高光譜敏感波段大都集中在1 100～1 650 nm附近，見圖1(b)。1 100～1 300 nm歸屬于C—H伸縮振動的二級倍頻[8]，1 300～1 400 nm歸屬于C—H伸縮振動的組合帶[9]，1 450 nm歸屬于O—H伸縮振動的一級倍頻，和蒼術顆粒劑中存在的水分有關[8]，1 480 nm附近歸屬于O—H伸縮振動的二級倍頻[9]。1 250～1 680 nm含有的信息和蒼術顆粒劑中的氨基酸有關。

圖1 蒼術顆粒劑(a)薄層色譜鑒定結果，(b)平均高光譜

2.2 不同廠家蒼術顆粒劑全波段建模區(qū)分及特征波長優(yōu)化

2.2.1 CARS及RF

基于全波段所建立的判別模型，KNN模型的總體判別率為96%，Kappa系數(shù)為0.937 8。BPNN，LS-SVM以及PLS-DA模型判別率都為100%，Kappa系數(shù)為1。

隨樣本運行次數(shù)增加，所選特征波長數(shù)目先迅速減少，隨后趨于平緩，見圖2(a)，表明在CARS中已經(jīng)實現(xiàn)了快速選擇、雙階段選擇及精選選擇。由圖2(b)可以看見，隨樣本運行次數(shù)增加，消除了部分冗余信息后RMSECV開始緩慢減少；當樣本運行次數(shù)為25次后，消除了部分關鍵波長下的光譜信息RMSECV開始緩慢增長；圖2(c)中“*”線表示RMSECV達最低值之最佳點，當樣本運行25次時，RMSECV值最小，獲得19個特征波長。RF方法可檢測每個波長下高光譜信息對不同廠家蒼術顆粒劑區(qū)分的重要性。波長被選擇幾率越大，表明該波長下高光譜信息與不同廠家的蒼術顆粒劑樣本區(qū)分的相關性可能較大[見圖2(d)]?；赗F方法將波長被選擇的概率從大到小排列，篩選出前10個波長組成波長數(shù)目從1～10的10組數(shù)據(jù)，并建立判別模型[圖2(e)和圖2(f)]。隨著波長數(shù)目的增加，模型的總體判別率以及Kappa系數(shù)總體均呈上升趨勢。當波長數(shù)目大于等于5時，除KNN外的另外三種模型總體判別率均達到了100%、Kappa系數(shù)達到了1且保持恒定。

2.2.2 相關性分析及優(yōu)化的波段

繼續(xù)計算選擇出的兩個敏感波長之間的皮爾森相關系數(shù)，兩個波長相關系數(shù)的值高于0.9的，只保留一個。

經(jīng)CARS-CA，RF-CA，SFS-CA以及SPA-CA分別篩選得到了4個、2個、4個以及3個最佳波長(表1)。

954 nm歸屬于C—H，N—H，O—H伸縮振動的三級倍頻[10]，975，1 476和1 483 nm歸屬于O—H伸縮振動的二級倍頻[11]，1 005 nm歸屬于N—H伸縮振動的二級倍頻[9]，1 122 nm歸屬于C—H伸縮振動[12]，1 220，1 126，1 146，1 237，1 294，1 348，1 365和1 368 nm為C—H的伸縮振動的二級倍頻[13]，1 372 nm歸屬于1 412 nm，1 415 nm歸屬于芳香烴的C—H拉伸振動[14]。

CARS選擇的特征波長，在1 100～1 300，1 360～1 420以及1 430～1 480 nm位置，和相關性分析結果一致。CARS-CA，RF-CA，SFS-CA和SPA-CA得到的最優(yōu)波長分別有2個(1 220和1 476 nm)，1個(1 442 nm)，1個(1 584 nm)、1個(1 146 nm)，均分布在對應的平均光譜差異度較大的區(qū)域，見圖3(a,b,c)。其中1 476，1 442與1 584 nm的信息都和蒼術顆粒劑中的氨基酸有關。

圖2 (a)CARS采樣變量數(shù)量的變化趨勢，(b)RMSECV值，(c)隨著采樣運行的增加每個變量的回歸系數(shù)，(d)通過RF選擇特征波長的結果，不同波長數(shù)目下不同模型的(e)總體判別率和(f)Kappa系數(shù)

圖3 蒼術顆粒劑廠家區(qū)分研究中(a)初步篩選特征波長，(b)CA篩選波長選擇結果，(c)基于CARS選擇的敏感波長之間的相關性分析

表1 基于高光譜技術的蒼術顆粒劑廠家區(qū)分特征波段選擇

2.3 基于特征波長建立的判別模型

基于CARS-CA，RF-CA，SFS-CA和SPA-CA選擇的最優(yōu)波長，和原始數(shù)據(jù)的256個波長變量相比，分別減小了98.44%，99.22%，98.44%和98.83%的變量，大大增加了模型的運算效率。

從表2可知，基于四種最佳波段建立的KNN以及BPNN模型的總體判別率均沒有達到100%，Kappa系數(shù)也沒有達到1?；谒慕M最佳特征波長建立的PLS-DA以及LS-SVM模型的總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的占比分別為25%以及50%，可以得出LS-SVM模型判別效果優(yōu)于其他三種?；贑ARS-CA所建立的四種模型，總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的占比為50%，優(yōu)于其他三組最佳特征波長。綜上所述，CARS-CA-LS-SVM模型在總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的情況下，大大減少了模型的輸入變量，提高了運算效率，為區(qū)分不同廠家蒼術顆粒劑的最優(yōu)模型。

表2 基于特征波長建立的區(qū)分不同廠家蒼術顆粒劑的模型判別Table 2 Model discrimination based on characteristic wavelengths in the distinguish study of Atractylodes Lancea granules from different manufactures

圖4 基于CARS-CA-LS-SVM模型的不同廠家蒼術顆粒劑區(qū)分結果圖

2.4 基于最優(yōu)模型建立的判別模型結果可視化

所有的蒼術顆粒劑樣本都能被正確識別(如圖4所示)，并且很容易與其他廠家區(qū)分。然而，廠家B的蒼術顆粒劑樣本有4個樣本的一些像素點被預測成了廠家C，本來應該被預測為黃色的一些像素點被預測成了紅色。其原因可能是該像素點的光譜攜帶了超出廠家C范圍的蒼術顆粒劑信息，當使用基于樣本平均譜的模型來預測相應的像素譜時，這些光譜特征會偏離樣本平均譜的預測集。整體來看，4個樣本所有像素點的顏色，還是預測為廠家B黃色的像素點較多，是準確的。

不同廠家蒼術顆粒劑的區(qū)分可視化是基于最優(yōu)模型和特征波長建立的魯棒性和代表性的判別模型，結果證明是可行的。為今后開發(fā)蒼術顆粒劑和其他中藥的綜合質(zhì)量實時監(jiān)測系統(tǒng)提供了可能。

3 結 論

高光譜技術結合CARS和CA法進行二次特征波長選擇，可有效實現(xiàn)不同廠家的蒼術顆粒劑可視化判別，實現(xiàn)了三個不同廠家蒼術顆粒劑的區(qū)分。剔除不相關或非線性變量的輸入變量，降低了計算量，提高了運算效率，為解決蒼術顆粒劑的無損質(zhì)量控制和產(chǎn)品溯源問題提供了參考。為開發(fā)基于特征波長的中藥制劑產(chǎn)品溯源多光譜檢測系統(tǒng)提供了科學支持。

下一步將進行更多生產(chǎn)廠家區(qū)分以研究參數(shù)的有效性，并擬擴大樣本數(shù)做進一步驗證和完善以建立更穩(wěn)定、更普遍適用的判別模型。